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摘要:【目的】表达并纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2(Nsp2),分析Nsp2的蛋白酶活性。【方法】本研究通过PCR分别扩增nsp2基因的N端和C端,利用原核表达载体pET21a(+)表达Nsp2蛋白的N端和C端(即Nsp2-N 和 Nsp2-C),通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析和凝胶过滤的方法纯化两个重组蛋白。预测Nsp2-N含有半胱氨酸蛋白酶结构域,本研究利用western blot检测其顺式酶切蛋白酶活性;并人工合成潜在的十肽底物,利用体外多肽酶切实验检测其反式酶切蛋白酶活性。成功获得Nsp2 相似文献
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摘要:【目的】筛选细胞内与A型流感病毒M2蛋白(A/M2)相互作用的蛋白质。【方法】将A/M2编码序列插入真核表达载体pCAGGS-CFlag,重组质粒pCAGGS-CFlag-A/M2转染HEK-293T细胞,裂解细胞,以Flag单抗偶联的琼脂糖球珠免疫沉淀A/M2-Flag蛋白,清洗去除非特异性结合的杂蛋白后,SDS-PAGE银染法显示与A/M2共沉淀的蛋白,从胶上切下此蛋白条带进行质谱分析。【结果】成功构建了A/M2的表达质粒,免疫印迹证实了A/M2蛋白在293T细胞中能够表达,免疫共沉淀筛选到与A/M2结合的多种蛋白,分析质谱结果,确定ataxin 10和3个真核翻译起始因子(eIF)为候选蛋白。【结论】ataxin 10与A/M2相互作用为流感病毒感染或接种流感疫苗引发小脑性共济失调提供了解释,eIF与A/M2相互作用表明A/M2可能在调控病毒蛋白合成方面起重要作用。 相似文献
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从青海湖20份水样筛选得到一株优势中度嗜盐菌QHL1,经初步鉴定为盐单胞菌属。设计保守基因ectB的引物,以基因组DNA为模板,PCR扩增获得ectB基因(1269 bp)。利用染色体步移技术,克隆获得四氢嘧啶合成基因簇ectABC及其上下游调控序列。DNAStar软件分析表明ectA、ectB和ectC位于同一个操纵子上,大小分别为579 bp、1269 bp和390 bp,预测分别编码192、422和129个氨基酸的肽链。同源性分析表明:Halomonas sp.QHL1ectABC基因簇所编码的二氨基丁酸转乙酰基酶(EctA)、二氨基丁酸转氨酶(EctB)和四氢嘧啶合成酶(EctC)与Halomonas sp.Nj223 ectABC基因簇所编码的酶蛋白相似性分别达57%、96%和85%。利用分子克隆技术构建二氨基丁酸转氨酶基因ectB的重组表达载体pET-28-ectB,通过限制性内切酶酶切和测序分析,结果表明其目的基因的插入位置、大小和读码框均正确。诱导表达重组菌,SDS-PAGE分析,目的蛋白条带约46 kDa。 相似文献
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