基于转录组的肝豆状核变性调控网络的构建和分析

本研究旨在利用生物信息学方法构建经铜诱导的ATP7B基因敲除HepG2细胞系的转录调控网络。探讨关键转录因子在肝豆状核变性发生、发展中的潜在作用机制。收集公共基因表达数据库（gene expression omnibus,GEO）中包含野生型、ATP7B基因敲除型、铜诱导的野生型和铜诱导的ATP7B基因敲除型HepG2细胞系数据。筛选由铜诱导产生的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）后进行基因本体论（gene ontology,GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析。基于蛋白相互作用网络,识别疾病关键基因和功能模块,并对关键功能模块中的基因进行富集分析。最后,构建转录调控网络,筛选核心转录因子。共筛选出1 034个差异表达基因,其中上调525个,下调509个。上、下调关键功能模块分别包括了3 785个和3 931个基因。关键功能模块中的基因主要定位于细胞-基质连接、染色体、剪接复合体、核糖体等区域,共同参与了mRNA加工、组蛋白修饰、RNA剪切、DNA代谢调节、蛋白磷酸化等生物学过程,且与转录共调控活性、DNA转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合等分子功能相关。KEGG分析表明功能模块中的基因显著富集的通路包括乙型肝炎、有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路、细胞衰老和凋亡、神经营养信号通路和神经变性途径等。肝豆状核变性转录调控网络包括11个差异表达转录因子和96个差异表达基因,其中U2AF1、NFRKB、FUS、MAX、SRSF1、CEBPA和RXRA为核心差异表达转录因子。该研究为肝豆状核变性转录调控相关分子的生物学功能研究提供了重要的参考依据。     

GTF2H2通过介导AKT信号通路影响肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移*

目的:探讨通用转录因子II H亚基2(GTF2H2)是否影响肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移及其潜在的分子机制。方法:通过转染GTF2H2-siRNA构建GTF2H2敲低的Hep3B肝癌细胞模型;实时定量聚合酶链反应(q-RT-PCR)和蛋白质印迹实验检测肝癌细胞Hep3B的GTF2H2敲低效果;细胞计数实验(MTS)检测GTF2H2敲低的肝癌细胞Hep3B的增殖能力;Transwell细胞迁移实验检测GTF2H2敲低的肝癌细胞Hep3B的迁移能力;蛋白质印迹分析实验检测GTF2H2敲低后是否影响肿瘤相关分子信号通路。结果: GTF2H2敲低组的Hep3B细胞的增殖能力较对照组的Hep3B细胞增强,迁移能力亦有增强;蛋白质印迹实验显示GTF2H2敲低后,p-AKT通路蛋白的表达明显升高。结论:GTF2H2可能通过介导AKT分子信号通路,影响肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移能力。     

基于CRISPR转录激活系统构建内源性着丝粒蛋白F稳定过表达的肝细胞癌细胞模型

临床研究表明着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生相关。由于CENPF蛋白的分子量高达358 kDa,目前有关CENPF致癌机制研究使用的体内外模型主要基于CENPF表达敲低,尚缺乏将CENPF过表达以探究其与癌变因果关系的研究,CENPF过表达改变到底是“因”还是“果”仍不清楚。本研究旨在利用包括lentiMPHv2和lentiSAMv2两个载体的CRISPR/dCas9转录激活协同激活介体(synergistic activation mediator,SAM)系统构建内源性CENPF稳定过表达的细胞模型,为阐明CENPF过表达与HCC发生发展的因果关系提供有效工具。首先设计并合成能够特异性识别CENPF基因转录起始位点的单向导核糖核酸(single guide RNAs,sgRNA),并将其插入lentiSAMv2质粒中。利用慢病毒载体将lentiMPHv2质粒导入Huh-7和HCCLM3细胞株中,用潮霉素B筛选后再用慢病毒载体将连接好的携带sgRNA序列的lentiSAMv2质粒导入细胞中,并用杀稻瘟菌素S继续筛选。对2种抗生素筛选获得的Huh-7和HCCLM3细胞株样品进行CENPF mRNA和蛋白表达水平的检测,结果显示sgRNA1和sgRNA4序列均能够激活内源CENPF的表达,其中sgRNA4诱导转录效果更加明显。本研究利用CRISPR/dCas9系统成功构建内源性CENPF稳定过表达的HCC细胞模型,为研究CENPF过表达与肿瘤发生的因果关系奠定基础,并为构建大分子量蛋白过表达的细胞模型提供参考方案。