青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅳ．宿主对青霉素酰化酶基因表达的影响

选用带青霉素酰化酶基因的HindI—A片段或HindI—A及其邻接的HindI—B,c片段的4种不同的质粒pPA2,pPA4,pPA 5,pPA 6分别转化于4种大肠杆菌宿主A56,c600,HBl01,Mcl000得16种转化子并测这些转化子的青霉素酰化酶活力。结果表明：同一质粒在不同宿主中青霉素酰化酶基因表达程度有明显差别,其中以A56为最高,其次是c600和Mcl000,而以HBl01为最低。在所试验的4个宿主菌中青霉素酰化酶基因表达都具温度依赖性,而且HindI—B片段对表达有相同程度的促进作用。用DNA-RNA点滴杂交试验测定青霉素酰化酶的信使RNA的量,发现同一质粒在不同宿主中信使RNA量的差异与酶活力的差异相一致。上述结果表明宿主在转录水平上影响了青霉素酰化酶基因的表达。     

苏氨酸操纵子的克隆与诱变

本文报道用Hind I+BamHI双酶切方法,从大肠杆菌K12的野生型菌株染色体上克隆苏氮酸操纵子的三个基因(thr A,thr B和thr C)到载体pBR322上,在合成培养基上筛选带thr操纵子的转化子。所得杂种质粒pTH1经羟胺体外诱变,筛选得到抗氨基酸类似物a-氧基-β-羟基戊酸(AHV)的突变质粒pTH2和pTH3,在宿主大肠杆菌C600中产苏氨酸最比初级克隆株高20倍以上,在解除天冬氨酸激酶—高丝氨酸脱氢酶(AKI—HDI)反馈抑制的宿主大肠杆菌A56—121中产苏氨酸量可达11g／L,比初级克隆株大肠杆菌 c600(pTHl)高100倍以上。     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达Ⅱ 质粒pPAl的限制性酶切图及青霉素酰化酶基因的定位

前文报道重组质粒pPAl中9．1kb的EcoRI片段上带青霉酰化酶基因。用16种限制性内切酶消化pPAl,其中ApaI,KpnI,SacI,SacI,SmaI及XhoI等六种内切酶在pPAl上无切口; BamHI,ClaI,Sph I,BglI为单切口;Sal为双切口,AvaI,HindI及PvuI为三切口,EcoRV为五切口。经交叉双酶解法测定各片段的大小,作出质粒pPAl的限制性酶切图。在包含青霉素酰化酶基因的9．1kbEcoRI片段上,BglI有一个切口,AvaI,HindI 及PvuI都有两个切口,而EcoRV有四个切口,SalI,BamHI,ClaIKSphI不切9．1kb的EeoR I片段。HindI切9．1kb EcoR I片段为A(3．5kb),B(2．7kb)及C(2,9kb)等三个片段。经Hind I部分水解后连接,转化大肠杆菌HB101得到一系列带不同Hind 1片段的质粒的转化子,青霉素酰化酶活性测定证明其基因位于Hin d II—A片段上。合成青霉素酰化酶仍需苯乙酸诱导,并被葡萄糖阻遏,Hind I—B片段的存在能增加青霉素酰化酶基因的表达,而c片段无显著影响。     

大肠杆菌质粒RK8的分离及生化分析

耐药质粒RK8是从上海水域中的耐药大肠杆菌的RK8细胞中分出的,通过接合转移、转化、琼脂糖凝胶电泳及电镜测定,证明它是可转移的质粒,编码3″-羟基磷酸转移酶。由凝胶电泳可看出两种质粒区带,经电镜测定,根据周长计算,它们的分子量分别为:37.3×10~6,27.4×10~6道尔顿。将RK8与pBR322进行重组,其重组体带Km、Am、Tc三种抗性,分子量比RK8大。