扩增片断长度多态性(AFLP)荧光标记和银染技术的比较分析

实验采用AFLP的荧光标记分析技术和常规的AFLP银染技术,对施用农药和未施用农药的狼蛛基因多态性进行分析.用4对引物扩增和银染法共检测出32条带,荧光标记技术共检测出223条带.荧光技术比银染方法在每个位点上多检测到24条带,检测效果更为理想,更适于进行遗传多样性分析和研究;对两种方法的费用和工作效率做了初步分析,AFLP荧光标记技术的检测效率是银染法的690倍,同时对AFLP荧光标记技术中低成本、高通量多重PCR体系的建立及Genescan软件数据分析中出现的一些具体问题进行了探讨.     

番茄总皂苷对小鼠高尿酸血症的调节作用北大核心CSCD

为研究番茄总皂苷对尿酸的调节作用,该文以番茄水提物为试材,利用次黄嘌呤和氧嗪酸钾以及尿酸和氧嗪酸钾建立高尿酸模型小鼠,考察番茄总皂苷对正常小鼠及高尿酸血症小鼠尿酸排泄量、血尿酸、尿素氮、肌酐、黄嘌呤氧化酶以及脏器指数的影响。结果表明:番茄总皂苷不影响正常小鼠血尿酸水平,正常组及番茄低、中、高剂量组血尿酸值分别为(170.4±36.7)、(178.3±69.7)、(175.5±42.1)、(185.3±72.6)μmol·L^(-1);番茄总皂苷对次黄嘌呤和氧嗪酸钾联合诱导的高尿酸血症小鼠可以降低血尿酸水平,降低黄嘌呤氧化酶活性,正常组、模型组及番茄高剂量组血尿酸值分别为(140.4±36.7)、(378.3±69.7)、(278.3±62.6)μmol·L^(-1),正常组、模型组及番茄低、中、高剂量组黄嘌呤氧化酶值分别为(1.2±0.3)、(1.8±0.2)、(1.6±0.2)、(1.5±0.3)、(1.3±0.4)U·g^(-1) liver;对尿酸和氧嗪酸钾联合诱导的高尿酸血症小鼠,可降低血尿酸水平,降低黄嘌呤氧化酶活性,正常组、模型组及番茄高剂量组血尿酸值分别为(98.8±21.8)、(455.6±78.8)、(333.7±68.7)μmol·L^(-1),正常组、模型组及番茄高剂量组黄嘌呤氧化酶值分别为(2.1±0.3)、(2.5±0.2)、(2.3±0.2)U·g^(-1) liver。综上结果表明,番茄总皂苷不影响正常小鼠血尿酸水平,但能降低高尿酸模型小鼠的血尿酸水平,其机制可能与降低黄嘌呤氧化酶活性有关。     

酶催化糖基转移反应在改善罗汉果苦味皂苷口味中的应用

罗汉果皂苷Ⅱ是罗汉果嫩果的主要皂苷成分,味道极苦,在罗汉果生产季节的末期大量滞长果(苦果)因为天气原因而产生,这些滞长果因体内的苦味皂苷尚未转化为甜味皂苷而被丢弃;另外,在罗汉果甜苷提取行业中,脱苦工艺同样会产生大量的苦味罗汉果皂苷Ⅱ。但在化学结构上,罗汉果苦味皂苷与甜味皂苷拥有完全相同的苷元部分,仅存在葡萄糖残基数目和位置的差别。该研究通过酶催化糖基转移反应将新的葡萄糖基团引入苦味的罗汉果皂苷Ⅱ中,可以延长其糖链,从而达到改善其口味的目的。该研究从原料选择、糖源选择以及反应温度等多方面考察了反应条件,最终确定的反应最佳条件为纯度在50%以上的罗汉果皂苷Ⅱ、2倍于皂苷重量的淀粉、60 U·g-1罗汉果苦味皂苷的酶、60~65℃反应24 h。经实际罗汉果苦果样品验证了方法的可行性,所获得的产品可以完全消除苦味,并且带有淡淡的甜味,经HPLC-MS确定了所获得的微甜产物为3~6个糖的皂苷混合物。该方法对于目前罗汉果生产中大量出现并被遗弃的嫩果、苦果以及脱苦工艺中产生的罗汉果皂苷Ⅱ而言,是一种潜在的实现废物利用的方法。     

恒河猴外周血单核巨噬细胞体外培养方法的建立

目的建立一种简单、经济、高效的培养恒河猴外周血单核巨噬细胞(monocyte-derived macrophage,MDM)的方法。方法用肝素钠抗凝管采集成年恒河猴(Macaca mulatta)全血,密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。同时用无抗凝剂采血管采集同一只猴外周血,自凝后分离血清。将猴PBMCs置于Cell BIND Surface的96孔(0.8×106个细胞/孔)或48孔培养板(3×106个细胞/孔)中,用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的RPMI 1640培养液培养24 h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FCS的新鲜培养基继续培养7 d后观察细胞形态学。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域。胞体形态多样,多数呈长梭形。用巨噬细胞标记受体(CD14)抗体染色判断细胞纯度。并用细菌内毒素(LPS)刺激分化的巨噬细胞,检测巨噬细胞炎性因子的表达。此外,用猴艾滋病毒(SIVmac17E-Br、SIVmac251)和人-猴嵌合体艾滋病毒(SHIV KU-1)感染分化良好的猴巨噬细胞,检测病毒在猴巨噬细胞中的复制。结果在含2%猴自体血清的RPMI 1640培养条件下,大多数(85%)猴单核细胞能在24 h内贴壁,体外分化5~7d后,猴巨噬细胞纯度大于96%。相比而言,含较高浓度(4%,8%或10%)猴自体血清或FCS的RPMI 1640培养基对猴单核细胞的贴壁和分化作用较差。分化良好的猴巨噬细胞对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。此外,这些细胞对SIV或SHIV均易感,产生感染性病毒。结论含2%猴自体血清的RPMI 1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法简单、花费少,无需生长因子,且分化效果好,是培养猴艾滋病毒及开展相关免疫学实验的重要手段。     

反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)对中国主要的丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型进行扩增。首先,收集临床采样标本,对其进行定量和定性。第二,分别根据HCV 1b和HCV 2a序列的5’非转录区(5’UTR)设计相应的RT-LAMP引物。第三,利用与非特异模板的交叉反应以评价各引物的特异性,利用内切酶酶切产物以进一步保证扩增准确。第四,利用倍比稀释的模板以评价各引物的灵敏性,并用依赖钙黄绿素/Mn2+的可视化方法与电泳结果比较。最后,利用RT-LAMP对所有采样标本进行HCV 1b和HCV 2a两组平行反应,SPSS统计学软件对其实用性初步评价。结果显示,所设计的RT-LAMP引物特异性好,HCV 1b和HCV 2a型产物大小均与预期相同。最低可检测的模板量为100IU/mL,且可视化染色方法电泳结果相一致。统计学软件比较扩增结果表明RT-LAMP与实时荧光定量PCR之间没有统计学差异(P0.05)。综上,RT-LAMP设备简单,操作简便,具有在基层医疗机构的应用前景。     

盐胁迫对不同生境盐地碱蓬光合及离子积累的影响

为了探讨盐地碱蓬(Suaeda salsa)适应不同生境的生理机制, 研究了盐处理(1、200和600 mmol·L^-1 NaCl)对盐碱地和潮间带两种生境盐地碱蓬地上部分及根系有机干重、叶片叶绿素含量及光合放氧速率、叶片和根中离子积累的影响。结果表明: 200 mmol·L^-1 NaCl对两种生境盐地碱蓬地上部分及根系的有机干重无显著影响, 说明两种生境盐地碱蓬均具有较强的抗盐性; NaCl处理显著降低了两种生境盐地碱蓬叶片的光合放氧速率; 各浓度NaCl处理下, 盐碱地生境盐地碱蓬叶片的光合放氧速率均高于潮间带生境的, 潮间带生境盐地碱蓬叶片中叶绿素a与叶绿素b的比值均高于盐碱地生境的; 各浓度NaCl处理下, 潮间带生境盐地碱蓬叶片中的Cl^-含量均低于盐碱地生境的; 与叶片中情况相反, 高盐处理下, 潮间带生境盐地碱蓬根中的Cl^-含量均高于盐碱地生境的。说明与盐碱地生境盐地碱蓬相比, 潮间带生境盐地碱蓬的根系可能对Cl^-具有较强的积累或限制其向地上部分运输的能力, 这些特征可能是盐地碱蓬适应不同生境的结果。     

聚乙二醇定点修饰集成干扰素突变体Ⅱ

目的：用聚乙二醇（PEG）修饰集成干扰素突变体Ⅱ（IFN-Con-m2,IIFNm2）,通过纯化获得新型修饰分子并对该分子进行抗胰蛋白酶水解稳定性及初步药代动力学研究。 方法：将mPEG20000定点偶联到IIFNm2的第86位Cys残基上,修饰后的产物经CM层析后,以SDS-PAGE考察其纯度,用WISH-VSV系统进行生物活性测定;在0.1%胰蛋白酶条件下考察体外抗酶解稳定性;并以SD大鼠进行初步药代动力学研究,绘制血药浓度-时间曲线。采用3P87软件进行数据拟合,分析药物动力学参数。 结果：干扰素修饰率约为50%,且绝大多数以单修饰体（mono-PEG- IIFNm2）形式存在;提纯后mono-PEG-IIFNm2 的纯度大于98%,比活性约为修饰前IIFNm2的1%。抗胰蛋白酶水解试验表明：30min后,IIFNm2抗病毒活性残留为8%,mono-PEG-IIFNm2为41%。初步药代动力学研究显示：IIFNm的消除半衰期为(1.57±0.34)h,mono-PEG-IIFNm2为(18.0±4.0)h。 结论：成功地偶联了PEG和IIFNm2,建立了mono-PEG-IIFNm2的纯化工艺,PEG修饰能增加IIFNm2的体外抗胰蛋白酶水解稳定性,并显著延长体内半衰期。     

微小型生物反应器及其在生物医药领域的应用展望

微小型生物反应器体积微小但在线分析检测和过程控制功能媲美台式装备。其核心支撑技术包括一次性材料及微加工技术、非接触式光学传感器、自动化以及实验设计 (DOE)、数据分析软件与过程控制的整合。由于体积微小、湍流程度和单位能耗较低,微小型反应器内的混合、传质、剪切特性与工业规模设备有一定的区别。现阶段微小型生物反应器主要用于菌株和细胞系筛选和工艺优化,在实现高通量工艺的同时确保了数据的丰度,对缩短研发周期和加速产品上市,尤其是在应对突发性传染性疾病方面有着重要的意义。未来,精准医疗概念的落实也依赖功能柔性化的微小型生物反应器系统。     

基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定研究

中药的有效性和安全性是国内外关注的热点,本研究以如意金黄散为例,基于DNA metabarcoding技术,尝试从投料药材真伪角度评价中药的有效性和安全性.首先,收集如意金黄散处方成分药材及其混伪品样品161份,从已发表文献中下载密切相关物种序列154条,构建"如意金黄散DNA条形码鉴定数据库",该数据库包含10属119个物种.收集不同批次的如意金黄散样品3份,以ITS2序列为条形码,使用Illumina HiSeq平台进行PE250深度测序,利用本研究构建的"如意金黄散DNA条形码鉴定数据库"进行投料药材基原物种识别,结果表明,基于DNA metabarcoding技术可检测到除厚朴外的全部处方成分,不同药材的测序量存在显著差异;检测到苍术药材的混伪品朝鲜苍术和天南星药材的混伪品虎掌南星,提示如意金黄散临床使用的有效性和安全性存在潜在风险;不同批次鉴定结果具有稳定性和可重复性.本研究表明,基于DNA metabarcoding技术的如意金黄散处方成分鉴定方法符合中药复杂体系特点,有望成为中成药鉴定的新方法,并为中成药的有效性和安全性评价提供参考.     

干扰素α1b对黑色素瘤细胞A375增殖、迁移和凋亡的影响

目的:研究干扰素α1b(IFN-α1b)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖、迁移和凋亡的影响。方法:采用体外培养的黑色素瘤细胞A375,通过MTT法检测和比较IFN-α1b和IFN-α2b对A375细胞的增殖的抑制作用;细胞划痕实验分析IFN-α1b对A375细胞迁移的影响;Annexin V-FITC/PI染色后采用荧光显微镜观察和流式细胞术分析IFN-α1b对A375细胞凋亡的影响。结果:MTT结果显示随着IFN-α1b和IFN-α2b浓度的增加,A375细胞的生长抑制率逐渐升高,药物作用48 h和72 h后,IFN-α1b作用的A375细胞生长抑制率明显高于IFN-α2b,IFN-α1b和IFN-α2b作用48 h的IC50分别为(22.69±1.52)μg/mL和(35.69±1.01)μg/mL(P0.01);IFN-α1b和IFN-α2b作用72 h的IC50分别为(10.00±0.98)μg/mL和(25.02±0.44)μg/mL(P0.01)。细胞划痕实验显示IFN-α1b能够使A375细胞的迁移指数和迁移能力降低,且随着IFN-α1b药物浓度的增加抑制细胞迁移作用增强。随着50μg/mL IFN-α1b作用的A375细胞的凋亡率为(29.31±0.45)%,较对照组(8.21±1.36)%相比明显上升(P0.01)。结论:IFN-α1b对人恶性黑色素瘤细胞A375具有生长抑制作用,与IFN-α2b相比,IFN-α1b的抑制作用更加显著;IFN-α1b能够降低细胞A375的迁移能力并诱导其凋亡。