具备定点偶联功能的HBc-VLPs的制备与性质鉴定

乙型肝炎病毒核心蛋白HBc,可在体外自组装形成二十面体对称结构的病毒样微粒VLPs。VLPs可将外源序列重复且高密度地展示在表面,VLPs进入机体后能够快速诱导机体产生针对外源性抗原的特异性体液免疫及细胞免疫应答,具有极强的免疫原性与生物活性。因此,HBc-VLPs可以作为一种安全、有效的疫苗载体。文中设计了一种能够实现与抗原定点偶联的HBc-VLPs,并开发了一套高效制备HBc-VLPs的方法。通过定点突变技术,使翻译后的多肽序列第80位氨基酸由Ala变为Cys,在HBc-VLPs的主要免疫显性区域引入一个定点交联位点,构建了原核表达载体pET28a(+)-hbc,表达、纯化获得了高纯度的HBc(A80C) 单体蛋白;在PB缓冲体系中,HBc(A80C) 蛋白自组装形成HBc-VLPs纳米粒子。粒度仪的测定结果表明,HBc-VLPs纳米微粒的平均粒径为29.8 nm,透射电子显微镜观察到HBc-VLPs形成粒径约为30 nm的球形微粒,其形态与天然的HBV微粒相似。以流感病毒M2e抗原肽为模式抗原,通过Sulfo-SMCC氨基-巯基双功能交联剂,将M2e定点连接于HBc-VLPs通过突变引入的Cys残基处,制备了M2e-HBc-VLPs模式疫苗,通过细胞荧光示踪,验证了HBc-VLPs结构的完整性与M2e的正确交联。动物免疫实验表明该疫苗能够有效刺激小鼠产生抗原特异性的IgG抗体,验证了疫苗载体HBc-VLPs的有效性。研究结果为HBc-VLPs作为疫苗载体的研究奠定了基础,能够促进HBc-VLPs载体疫苗的研发以及HBc-VLPs在其他领域的应用。     

细菌性腹泻三联口服疫苗的研制及其免疫效果的初步评价

由细菌引起的感染性腹泻,至今仍是世界范围广泛流行的传染病之一。由于耐抗生素病原菌的不断涌现,导致了抗生素药物的治疗效果不佳。因此,研发便捷、有效的疫苗对于细菌性腹泻的预防与治疗尤为重要。针对产肠毒素大肠杆菌、霍乱弧菌与志贺氏痢疾菌这三种最为主要的细菌性腹泻病原菌,设计和筛选了以热不稳定肠毒素亚基蛋白为抗原和黏膜佐剂、霍乱弧菌鞭毛蛋白及志贺毒素亚基蛋白为抗原的三联疫苗。通过工程大肠杆菌获得了相应的抗原与佐剂蛋白,并以海藻酸钙-壳聚糖微球为疫苗的口服载体,制备了疫苗的口服制剂。体外实验表明,微球载体中的蛋白质在模拟胃液中释放较低,但在模拟肠液中释放迅速,这种载体能够实现疫苗在肠道内定向释放的目的。通过对灌胃免疫后小鼠免疫指标的检测,证明了疫苗能够刺激机体产生抗原特异性的sIgA与IgG抗体,免疫组与对照组相比,差异显著(P0.05),并提升了外周血中CD4~+T细胞的含量(7.5%~9.5%)与CD4~+T/CD8~+T细胞的比率,有效地激活了机体的黏膜免疫与系统免疫,能够对机体起到保护作用。