肺癌相关肿瘤抗原基因的分离及鉴定

通过分离肺癌肿瘤抗原 ,为肺癌早期诊断提供血清学标志物 ,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原 ,成功构建了库容为 0 .8× 10 6个重组子的肺癌原发病灶组织的cDNA表达文库。采用SEREX技术对该cDNA表达文库进行筛选 ,获得了 33个阳性克隆 ,包括黑色素瘤抗原基因 (MAGE)、白斑相关蛋白基因、纤连蛋白基因、钠钾ATP酶基因等已知基因或EST ,另外有 18个基因或EST在GenBank数据库中没有同源性 ,可能是新的基因或EST。选取其中 3个克隆进行肺癌患者及正常人群血清的检测 ,结果显示肺癌患者的阳性率明显高于正常人群     

低氧提高肿瘤细胞反义VEGF165基因表达

为了探讨反义VEGF1 65基因对食管癌的抑制作用 ,并初步探讨利用肿瘤低氧微环境改善基因治疗的效果 ,采用PCR技术和DNA重组技术构建了含低氧反应元件的真核表达载体 ,并用此载体构建了含荧光素酶报告基因和反义VEGF1 65基因的重组载体。用脂质体将重组载体导入食管癌细胞 ,体外用化学发光光度计测定低氧对报告基因表达的调节和ELISA法间接测定低氧对反义VEGF基因表达的调节作用。体内利用裸鼠皮下移植实验研究低氧对反义VEGF1 65基因抑瘤作用的影响。体外实验表明 ,用带低氧反应元件的重组真核表达载体转染食管癌细胞 ,在低氧培养下可以使报告基因的表达提高 3 780 % ,并可以显著提高反义VEGF1 65基因的表达 ,体内用带低氧反应元件的载体将反义VEGF1 65基因导入食管癌细胞中 ,其抑瘤效果显著优于不含该元件的载体 ,抑瘤率分别为 71 .7%和 5 6 .1 %。反义VEGF1 65基因能显著抑制食管癌的生长 ;利用肿瘤低氧可以实现治疗基因的自主调节 ,改善基因治疗的效果     

抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体 (HAMA)反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185 erbB2 人 /鼠嵌合抗体 ,将抗人P185 erbB2 单抗C2 5的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱动的选择标志基因的真核表达载体中 ,共转染CHO dhfr-细胞 ,经G418及氨甲喋呤 (MTX)梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达。采用RT PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化学等实验证实了所表达的抗人P185 erbB2 嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达 10 0mg/L ,所表达的嵌合抗体具有抑制P185 erbB2 高表达肿瘤细胞增殖的作用     

抑制消减杂交分离肿瘤血管生成相关基因

为获得肿瘤血管生成相关基因 ,以便为抗血管形成治疗肿瘤的新策略提供有价值的靶位 ,采用人新鲜的肝癌、肺癌组织匀浆活化人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) ,并构建了cDNA表达文库 .利用抑制消减杂交 (SSH)获得活化HUVEC高表达的基因片段 ,放射标记后筛选文库 .获得的阳性克隆进一步进行差异杂交筛选 ,去除假阳性 .共获得了 177个阳性克隆 ,对其中 74个克隆进行序列分析 ,发现它们代表 32个基因 ,其中多个与肿瘤血管生成相关 ,1个为与细胞色素c氧化酶亚单位Ⅲ同源的新基因 ,2个为功能未知的假定蛋白基因 .研究结果表明 ,用肿瘤组织匀浆模拟肿瘤内环境活化HUVEC ,并通过比较活化前后基因表达谱的差异可以分离到肿瘤血管生成相关的基因 .     

抗人P185^erbB2嵌合抗体的CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体（HAMA）反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185^erbB2人／鼠嵌合抗体,将抗人P185^erbB2单抗C25的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱地劝的选择标志基因的真核表达载体中,共转染CHO－dhfr^-细胞,经G418及氨甲喋呤（MTX）梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达,采用RT－PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化等实验证实了所表达的抗人P185^erbB2嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达100mg/L,所表达的嵌合抗体具有抑制P185^erbB2高表达肿瘤细胞增殖的作用。     

采用亲和层析结合制备凝胶电泳获得高纯度的重组抗原蛋白用于制备蛋白质芯片

为了得到制备抗原芯片所需的高纯度重组抗原蛋白,需要建立一套适合于多种重组抗原表达和纯化的技术路线．采用了亲和层析结合制备胶电泳的方法,对16种用于构建蛋白质芯片的食管癌相关抗原基因进行了克隆重组并在大肠杆菌中进行了表达．对高表达的重组蛋白首先制备包涵体,然后采用Ni-Sepharose亲和层析得到初步纯化的蛋白质,最后使用SDS-PAGE制备胶电泳作进一步纯化．经过透析复性后,用于制备蛋白质芯片．采用亲和层析纯化重组蛋白,得率为71% ,纯度约为70%;在SDS-PAGE制备胶进一步纯化后,得率为32%,纯度为95%,经过透析和复性后,最终得率为21%,纯度为95%．得到的重组蛋白RPS4在ELISA检测中可以和血清中识别RPS4 的自身抗体起反应,并且,采用精纯抗原制备的蛋白质芯片,在检测抗原与抗体这一对反应中也具有较高的敏感性和特异性,适合大规模血清抗体的检测．研究表明,采用亲和层析结合制备凝胶电泳纯化抗原蛋白,是一条简便快捷,适合需要量不大,但对纯度要求比较高的蛋白质芯片制备的技术路线．