Serratia marcescens H30脂肪酶的重组可溶表达、固定化及其酶学性质

为了提高Serratia marcescens H30脂肪酶的可溶表达水平,分别将目的基因与p GEX-4T-1、p ET28a和p ET32a构建重组表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),通过优化诱导过程,发现可溶性酶的最高活性可达25 000 U/L。再经Ni2+亲和柱纯化、LH-EP固定化后,固定化酶的比酶活为214 U/g(以1 g湿质量计),酶活回收率为51%。固定化后重组脂肪酶的最适温度由30℃提高到35℃,最适p H从7.0偏移至8.0左右,并且稳定性也有所增加。该固定化重组脂肪酶同样能够拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯,光学选择性没有改变。反应14 h,转化率为48.5%,底物的e.e.值为99.2%,表明该固定化脂肪酶能有效拆分消旋体反式-4-甲氧苯基缩水甘油酸甲酯,为工业生物催化制备地尔硫卓提供了可能。     

氧化葡萄糖酸杆菌中一种潜在的双组分系统蛋白的功能研究

氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)基因组编码的蛋白质中,有相当数量的传感器激酶和反应调控蛋白组成了细菌的多个双组分信号转导系统(two-componentsignaltransduction systems, TCSs),这些系统能够介导细菌对外界环境变化做出反应。但目前对G. oxydans中潜在的双组分系统成员蛋白质结构和功能缺少必要的研究【。目的】研究菌株G. oxydans 621H中GOX0645基因序列所编码蛋白质的自磷酸化活性,探究其与细菌趋化性运动的关联,揭示其是否作为一种双组分系统成员蛋白在细胞内发挥作用。【方法】以菌株G. oxydans 621H基因组中一段可能编码双组分系统蛋白质的基因GOX0645为基础,通过生物信息学分析其保守结构域;采用体外化学发光实验证明其编码蛋白的自磷酸化活性;利用基因定点突变筛选出与自磷酸化活性相关的氨基酸位点;通过差速离心法寻找双组分蛋白的亚细胞定位;最后运用体内双分子荧光互补和体外生物大分子相互作用实验印证其与下游鞭毛马达蛋白之间的相互作用。【结果】生物信息学分析发现GOX0645编码蛋白同时具有组氨酸激...     

基于sRNA的氧化葡萄糖酸杆菌基因调控的研究

在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具。通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点(RBS)的相互作用,在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控。以绿色荧光蛋白作为报告基因,在所构建的顺式调控系统中,插入RBS上游的顺式阻遏序列,能够在转录后与RBS形成茎环结构,从而抑制报告基因的表达。这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开,从而重启报告基因的翻译;在所构建的反式调控系统中,由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链,通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达。在此基础上,设计并导入了一系列反式作用的小RNA,实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstI表达的抑制。本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法。     

基于sRNA的氧化葡萄糖酸杆菌基因调控的研究北大核心CSCD

在氧化葡萄糖酸杆菌中建立一种调控基因表达的工具。通过顺式/反式作用的非编码小RNA与核糖体结合位点(RBS)的相互作用,在翻译水平上对氧化葡萄糖酸杆菌中目标基因的表达进行调控。以绿色荧光蛋白作为报告基因,在所构建的顺式调控系统中,插入RBS上游的顺式阻遏序列,能够在转录后与RBS形成茎环结构,从而抑制报告基因的表达。这一茎环结构能够被与顺式阻遏序列具有更高亲和力的抗阻遏序列打开,从而重启报告基因的翻译;在所构建的反式调控系统中,由独立启动子控制转录的非编码小RNA与RBS互补形成双链,通过阻碍核糖体与mRNA的结合抑制报告基因的表达。在此基础上,设计并导入了一系列反式作用的小RNA,实现了对氧化葡萄糖酸杆菌中内源基因pstI表达的抑制。本研究提供了一种在氧化葡萄糖酸杆菌中不同于传统基因敲除的调控基因表达的方法。     

原核细胞中可调控人工转录元件的构建与表征

人工转录装置可以按照所设计的方式在原核细胞和真核细胞中调节基因表达。本研究在大肠杆菌中设计并构建了一种由合成启动子和人工转录因子构成的人工转录装置:其中,合成启动子包含了一种弱启动子P_(lac)突变体与位于其上游的λ噬菌体操纵区(O_R2或O_R3)的不同组合,而人工转录因子则利用细菌RNA聚合酶α亚基的N端和λ噬菌体CI蛋白的C端组成的融合蛋白α-CI作为效应域,CI蛋白作为DNA结合结构域。利用绿荧光蛋白作为报告基因对这一人工转录装置检测发现,它可以成功开启报告基因的转录活性。随后通过改变这一人工转录装置的某些参数,例如,增加启动子上游操纵序列的拷贝数、使用温敏型CI取代野生型CI、在系统中引入CI的阻遏蛋白Cro等多种方式,实现了对报告基因转录强度的精细调控。这一人工可调控转录装置可以在原核细胞中实现对报告基因表达强度的精细调控,在原核细胞中调节基因线路的信号输出强度方面具有一定的应用前景。     

重组HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制备及其促癌细胞凋亡活性研究

从人乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin的cDNA,并对其中编码34位Thr的密码子定点突变为Ala的密码子后,经一系列基因操作方法将天然HIV-TAT转导肽的突变体基因HIV-TATm引入Survivin(T34A)基因的5′端,正确构建了表达载体pRSET-B-HIV-TATm-Survivin(T34A),经转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,目的蛋白质以包涵体形式表达,占菌体总蛋白的45%。经3.7L发酵罐分批发酵可收获650mg/L的包涵体,经阳离子交换、凝胶层析分离和柱上复性与透析,得到纯度达96%以上的可溶性目的蛋白HIV-TATm-Survivin(T34A)。目的蛋白对人乳腺癌细胞B-Cap-37、人胰腺癌细胞SW1990和人肝癌细胞SSMC-7721作用4h后有在细胞形态上呈现出显著的凋亡特征,而对人宫颈癌细胞系Hela不敏感,对正常的人内皮细胞系EVC-304未见明显影响。作用24h时MTT法检测显示,120μg/mL目的蛋白对SW1990、B-Cap-37、SSMC-7721和Hela细胞的抑制率分别达到89%、63%、59.5%和39%,且具有剂量依赖性。对最为敏感的SW1990和B-Cap-37以每孔60μg/mL终浓度的目的蛋白作用48h的流式细胞技术检测发现,凋亡率分别为25.6%和19.3%,与对照相比,实验组细胞出现明显的凋亡峰,细胞周期的分布发生明显的变化,65%以上的癌细胞被阻滞于G1期。体外实验结果显示重组目的蛋白具有较强的抑制癌细胞增殖和促进凋亡作用,预示着良好的抗癌前景。     

受水杨酸盐浓度调控的细菌遏制系统

由于存在基因工程微生物(GEMs)不受控制地在环境中释放的风险, 利用GEMs的生物降解能力治理环境污染的方法受到了限制。在大肠杆菌JM109中构建了一个受环境污染物调控的细菌遏制系统, 该系统是由杀伤元件和调控元件组成的双质粒体系, 使细菌的存活受环境中水杨酸盐浓度的调控。当培养基含水杨酸盐时, 阻遏蛋白LacI合成, 阻止自杀基因gef表达, 细菌快速繁殖; 当水杨酸盐不存在时, 自杀基因gef的表达导致细胞杀伤, 菌体大量死亡。该遏制系统可作为模型用于具有生物修复功能的基因工程菌的构建。     

基于布鲁姆教育目标体系构建分子生物学实验综合考评体系

大学生创新能力培养是一项系统工程,实验实践教学的实施和评价是其中的重要环节。华东理工大学分子生物学教研组以布鲁姆教育目标体系为指导,构建了包括过程评价、结果评价和实践创新能力评价三个模块的分子生物学实验综合考评体系。该考评体系通过在两个教学周期中的实施,实现了对学生全方位的训练、考核和综合评价,从而有力提升了生物科学和生物技术专业学生的综合能力和科学素养,在创新型人才培养方面发挥了积极的作用。