金鱼草AmPDS基因克隆及调节类胡萝卜素合成功能分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)是类胡萝卜素进行生物合成途径中的关键酶。为了深入探究金鱼草PDS基因的功能,该研究以‘马里兰’金鱼草(Antirrhinum majus‘Maryland True Pink’)为材料,对其PDS基因(AmPDS)全长序列及蛋白结构进行分析,并克隆了AmPDS基因片段;采用qRT-PCR技术检测AmPDS基因在不同时期及部位的相对表达水平,利用VIGS技术验证AmPDS基因功能,用紫外分光法测定叶片中各类色素含量。结果显示:(1)成功克隆AmPDS基因片段(500 bp);AmPDS基因cDNA全长1743 bp,编码580个氨基酸;其蛋白分子量为64.75 kD,理论等电点6.66;同源比对分析显示AmPDS基因与芝麻(Sesamum indicum)的序列相似性最高。(2)qRT-PCR分析表明,AmPDS基因在全株均有表达,且在全盛期花朵的上瓣和叶片中表达量最高。(3)构建pTRV2-AmPDS载体,建立了金鱼草的VIGS沉默体系,AmPDS基因沉默效率约为53%,与阴性对照相比叶片中各类色素含量均显著降低。研究认为,AmPDS基因是金鱼草类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因,可作为金鱼草VIGS沉默体系的指示基因,为后续研究金鱼草其他基因功能奠定基础。     

金鱼草AmPIF4基因克隆及调控花香物质合成释放功能分析

为了研究光敏因素互作因子(phytochrome interacting factors,PIFs)在光诱导花香物质合成释放中的调控作用,该研究从‘马里兰’金鱼草 (Antirrhinum majus ‘Maryland True Pink’)中克隆PIF4转录因子(AmPIF4)编码区序列,进行生物信息学分析、亚细胞定位和瞬时表达载体转化烟草,研究AmPIF4蛋白在细胞中的分布;并采用qRT PCR 技术检测AmPIF4基因的时空表达,运用病毒诱导的基因沉默(VIGS)验证基因功能,采用ATD GC/MS技术测定花香成分含量。结果显示：(1) 成功克隆到AmPIF4基因开放阅读框全长1 497 bp,编码498个氨基酸;理论分子量55.58 kD,理论等电点6.44;同源比对分析显示AmPIF4蛋白与芝麻(Sesamum indicum)序列相似度最高。(2)AmPIF4蛋白主要定位于细胞核。(3) 实时定量分析表明,AmPIF4基因在金鱼草各个时期及不同器官、组织中均有表达,而在花盛开期达到最高,其中在盛开期的叶片中表达量最高,但叶片与茎和萼片中的表达差异不显著。 (4)基因沉默使金鱼草花瓣中AmPIF4基因的相对表达量较野生型显著下调约65%,且与阴性对照相比AmPIF4表达量也显著降低,同时使金鱼草花瓣中主要花香挥发物成分月桂烯、罗勒烯、苯甲酸甲酯较野生型分别显著增加了22%、24%、12%,花香释放量总体含量上升。研究表明,AmPIF4对花香物质合成释放有负调控作用,可能参与光对花香次生代谢的调控。     

金鱼草AmHMGS基因的克隆及表达特征分析

植物萜烯类化合物合成主要通过MVA和MEP途径,这些萜烯类化合物在植物生长、发育过程发挥着重要作用,萜烯类化合物在植物花香挥发成分中占有大比率.3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(HMGS)是MVA途径中的关键酶基因,该酶作用主要是催化底物乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA),是合成萜烯类化合物的前体限速酶.本研究以'马里兰'金鱼草(Antirrhinum majus'Maryland')为材料,克隆AmHMGS,基因全长1 383 bp,编码460个氨基酸,时空和组织特异性RT-qPCR表达分析表明,AmHMGS基因在花中表达量显著高于根茎叶;初开期的表达量最高;在盛花期的不同花器官中,AmHMGS基因在雄蕊和上瓣中表达量最高,与其它花器官中的表达量差异显著.用茉莉酸抑制剂不同浓度的菲尼酮处理盛开期金鱼草花瓣,RT-qPCR分析HMGS基因表达量结果表明,菲尼酮处理后能抑制该基因的表达.本研究的结果为明确AmHMGS基因在金鱼草中的表达模式,为今后研究该基因的功能及其在金鱼草花香释放中的信号作用奠定基础.