CDC6靶向RNA干扰质粒载体的构建及生物活性鉴定

目的:构建小鼠CDC6基因的RNAi真核表达载体PGCsilencer TM u6/Neo/GFP/RNAi,观察其转染小鼠肝细胞前后CDC6的表达变化。方法:根据GenBank中CDC6的序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至PGCsilencer U6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,用脂质体将重组子转染至正常小鼠肝细胞中,用RT-PCR检测CDC6的mRNA的表达及用Western blot方法检测CDC6蛋白水平的表达,并比较转染前后其表达水平的变化。结果:经测序,模板序列与设计序列完全正确,经过RT-PCR及Western blot方法检测,转染干扰质粒后,小鼠肝细胞中CDC6表达在mRNA及蛋白水平都有明显的下降。结论:成功构建了CDC6基因的RNAi真核表达载体并转染至小鼠肝细胞中,为下一步探讨CDC6在肝再生的作用奠定了基础。     

大鼠肝部分切除术后mTOR信号通路对肝再生的作用

目的:探讨mTOR信号通路对大鼠肝部分切除术后肝细胞蛋白质合成功能及肝细胞大小的影响。方法:采用Sprague-Dawley雄性大鼠70％肝切除模型和肝细胞分离与培养方法,在术后不同的时相点分离残肝的肝细胞,进行培养。实验分组:分离的残肝肝细胞分两组:对照组(Control组、C组)、雷帕霉素组(Rapamycin组、R组)。采用Western blot方法检测磷酸化mTOR蛋白在不同时相点的变化;采用3H-亮氨酸(3H-Leucine)掺入法测定肝细胞蛋白质合成;扫描电镜(AMRAY 1000B,US)获取肝细胞图像,病理图像分析系统(北航CM2000B)测定细胞面积。结果:1)C组中,磷酸化mTOR蛋白的含量由0h开始升高,6h达到高峰,以后即降低,而R组明显较C组含量降低;2)在术后的各时相点,C组的肝细胞的蛋白质合成率较R组显著升高(P<0．05),而且随时间点的延长,蛋白质合成率呈上升趋势;3)在2h和6h时相点C组肝细胞面积较R组显著增大(P<0．05)。但是,在C组肝细胞24h时相点面积较2h和6h减小(P<0．05)。结论:体外实验证实,肝部分切除术后mTOR信号通路即活化,促进肝细胞的蛋白质合成和细胞生长。因此,我们推测mTOR信号通路在肝再生过程中发挥重要作用。