降胆固醇活性肽检测方法的研究进展

综述近年来国内外胆固醇以及具有降胆固醇活性的小分子肽在体内和体外的检测方法,为研究胆固醇代谢和降胆固醇活性小分子肽的研究提供参考。     

OGT 多克隆抗体的制备及特异性分析

目的:为了探讨O-GlcNAc糖基转移酶OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体。方法:在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(464-949位点氨基酸)做抗原。首先,构建OGT的C末端催化结构域(464-949位点氨基酸)的重组表达载体pET30-a-OGT-C,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白。再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果:多抗效价达1:80000;在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。结论:实验结果表明,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。     

M.natoriense TNJL143-2菌的D-氨基酰化酶的固定化研究

D-氨基酰化酶可用于D-氨基酸的生产,本研究利用来源于Microbacterium natoriense TNJL143-2的D-氨基酰化酶,分别通过琼脂糖包埋、介孔二氧化硅MCM-41和SBA-15吸附,制备了三种固定化酶,并对三种固定化酶的固定化条件、酶学性质、活性保持时间、重复使用次数、米氏常数等参数进行了研究。结果表明,MCM-41载体固定化酶的蛋白固定率为91.6%,SBA-15载体固定化酶的蛋白固定率为88.0%,琼脂糖包埋法蛋白固定率为79.5%。MCM-41、SBA-15以及琼脂糖三种载体固定化酶最适反应pH均为7.0,最适反应温度范围均为37℃。在固定化酶的活性保持时间以及重复利用活性方面,SBA-15固定化酶同样优于其他两种固定化酶。以D型苯丙氨酸(D-Phe)为底物时,琼脂糖包埋固定化酶的Km为28.8 mol/L,SBA-15固定化酶的Km为25.9 mol/L,MCM-41固定化酶的Km为25.0 mol/L。同时本文还探索了三种固定化酶的pH使用范围及酸碱稳定性、温度使用范围及热稳定性,结果显示,SBA-15作为固定化载体均表现出较广的适用范围及较高的稳定性。在不同条件的反应体系中,SBA-15固定化酶的蛋白损失率始终小于其他两种固定化酶。