极端嗜热古菌———芝田硫化叶菌DNA 连接酶的生化性质

极端嗜热古菌———芝田硫化叶菌 DNA 连接酶 (Ssh 连接酶 ) 的最适辅因子为 ATP ,在 dATP 存在时,该酶也能表现出较弱的连接活性 . ATP 或 dATP 都能够使该酶发生腺苷化,腺苷化的 Ssh 连接酶能够将腺苷基团转移至含切刻的 DNA 上 . 电泳迁移率改变实验表明, Ssh 连接酶能够结合双链 DNA ,且与含切刻及不含切刻的 DNA 结合的亲和力相同,但不结合单链 DNA. 酵母双杂交实验显示,硫磺矿硫化叶菌 ( 与芝田硫化叶菌亲缘关系很近 ) 的 DNA 连接酶,与该菌所含的 3 个增殖细胞核抗原 (PCNA) 同源蛋白中的一个 (PCNA-1) 有相互作用,而与另外 2 个同源蛋白 (PCNA-like 和 PCNA-2) 则无相互作用 . 在古菌中高度保守的 Sac10b 蛋白家族成员 Ssh10b 能够激活 Ssh 连接酶的活性,而硫化叶菌中的主要染色体蛋白——— 7 ku DNA 结合蛋白 (Ssh7) 则对该酶活性没有影响 .     

Evolutionary conservation and DNA binding properties of the Ssh7 proteins from Sulfolobus shibatae

The thermoacidophilic archaeon Sulfolobus shibatae synthesizes a large amount of the 7-ku DMA binding proteins known as Ssh7. Our hybridization experiments showed that two Ssh7-encoding genes existed in the genome of S. shibatae. These two genes, designated ssh7a and ssh7b, have been cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The two Ssh7 proteins differ only at three amino acid positions. In addition, the cis-regulatory sequences of the ssh7a and ssh7b genes are highly conserved. These results suggest the presence of a selective pressure to maintain not only the sequence but also the expression of the two genes. We have also found that there are two genes encoding the 7-ku protein in Sulfolobus solfataricus. Based on this and other studies, we suggest that the gene encoding the 7-ku protein underwent duplication before the separation of Sulfolobus species. Binding of native Ssh7 and recombinant (r)Ssh7 to short duplex DNA fragments was analyzed by electrophoretic mobility shift assays. Both n     

环境样品中DNA的分离纯化和文库构建

采用研磨 /冻融和SDS/蛋白酶K热处理等理化方法 ,直接从性质不同的环境样品中提取和纯化混合基因组DNA。所获得纯品DNA的产量为每克样品 2～ 1 6μg。对纯品DNA进行限制性内切酶处理后 ,构建了以pUC1 8为载体的DNA文库。建库效率为从每克环境样品获得约 1 0 3～ 1 0 4 个含 3～ 8kb外源随机插入片段的克隆。通过DNA序列测定和基因注释 ,对从文库中随机选取的克隆进行了分析 ,发现外源插入片段均含序列未见报道的新基因。本文所做的尝试对于保存、研究和开发未培养微生物基因资源具有意义     

新肝炎病毒TTV在各类高危人群中的感染状况和分子流行病学研究

目的观察新肝炎病毒TTV在各类高危人群中的感染状况、基因分型及其在肝病发生和发展过程中的作用。方法在日本株TTVORF1保守区设计了两对套式引物,采用巢式聚合酶链反应扩增血清TTVDNA,并对产物进行分子克隆和部分基因序列分析。结果在非甲-戊型和非庚型肝炎病人、血清HBsAg阳性的肝炎病人、正常献血员、肝炎肝硬化病人、原发性肝癌病人、静脉内吸毒者和女性与男性性乱者中,血清TTVDNA阳性率分别为43.2％(16/37)、28.8％(15/52)、9.3％(4/43)、51.9％(14/27)、38.5％(5/13)、35.0％(14/40)、17.3％(8/45)和18.8％(3/16)。其中非甲-戊型和非庚型肝炎病人、血清HBsAg阳性肝炎病人的ALT平均为(472士276)u·L-1和(385士218)u·L-1;肝炎肝硬化病人TTVDNA阳性率显著高于HBsAg阳性肝炎病人。同时,从非甲-戊型和非庚型肝炎病人、血清HBsAg阳性肝炎病人、正常献血员、静脉内吸毒者和女性性乱者中,分别获得6份TTVDNAORF1克隆,其基因序列与日本株TTVORF1部分基因核苷酸序列同源性为97％～99％,均属于TTV1a型。结论TTV感染和ALT升高存在一定的关系;我国各类高危人群感染TTV以1a型为主,TTV基因型与疾病发生和传播方式关系不大。国内首次报导性传播的TTVDNA基因型。     

小鼠金属硫蛋白-Ⅰ在鱼腥藻7120中的融合表达及其纯化

为了提高小鼠金属硫蛋白-Ⅰ(mMT-Ⅰ)在鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)中的表达量、便于表达产物的分离纯化,构建了新的穿梭融合表达载体pKG-MT.通过pKG-MT,mMT-Ⅰ cDNA在tac启动子的调控下,以与谷胱甘肽转硫酶(GST)C-末端相融合(GST-MT)的形式在鱼藻中表达.SDS-PAGE结果显示在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下GST-MT在鱼腥藻中表达.经谷胱甘肽亲合层析,从转基因藻中分离、纯化得到GST-MT.利用GSTC-末端的凝血酶酶切位点,用凝血酶对GST-MT进行柱上酶切,经Sephadex GS0除去凝血酶得到mMT-Ⅰ.SDS-PAGE表明纯化得到所要的目标产物;ELISA测定结果显示从每克转基因藻(鲜重)中可纯化得到0.9 mg mMT-Ⅰ;原子吸收测定表明纯化得到的mMT-Ⅰ的镉离子结合能力接近于天然MT.     

极端嗜热古菌——芝田硫化叶菌DNA结合蛋白Ssh12对DNA超螺旋的影响

通过SPSepharose,DNA纤维素和磷酸纤维素等柱层析 ,从极端嗜热古菌———芝田硫化叶菌 (Sulfolobusshibatae)中纯化得到分子量为 11.5ku的DNA结合蛋白Ssh12 .Ssh12约占细胞总蛋白的 4% .该蛋白既能与负超螺旋DNA也能与松弛DNA结合 .利用含单切刻环状DNA进行的切刻闭合分析表明 ,Ssh12在与DNA结合时能够固定负超螺旋 .这种能力在室温 ( 2 2℃ )下很弱 ,而在 3 7℃以上则大大增强 .Ssh12的细胞内含量和固定负超螺旋的能力提示 ,该蛋白对于芝田硫化叶菌染色体DNA的组织以及热稳定性起着重要作用 .     

人类聚居地的古树:分布格局、驱动因素与保护实践

古树是人类聚居地最具标志性的生物体,具有极其重要的社会文化和生态价值。由于人类活动和气候变化的影响,全球范围内的古树正面临衰退。如何保护人类聚居地的古树及其社会文化和生态价值是科学家和林业管理者需要共同思考的问题。尽管目前在世界范围内有一定数量的古树研究论文发表,但仍然缺乏对人类聚居地古树研究现状和观点的总结。我们从古树的社会文化和生态价值、分布格局和驱动因素、保护的文化根源和保护实践,以及古树保护面临的挑战等方面对目前人类聚居地古树的研究现状和观点进行了综述。希望能够对未来古树的研究提供一定的思考和启发,并为古树的可持续保护提供建议和参考。     

云南腾冲热泉土壤微生物基因组文库的构建与分析

采用冻融、蛋白酶K、SDS-高盐-加热处理法联合的方法,直接从云南腾冲地区的一个弱碱性高温热泉沉积样品中提取和分离环境混合基因组DNA,产量为每克样品1~2μg DNA,用Promega试剂盒纯化后进行PstⅠ部分酶切处理,电泳回收3~8kb的片段后,构建了pSK( )为载体的基因组文库,共获得25000个阳性克隆,平均插入片段长度为4.6kb。通过随机DNA序列测定和基因注释,发现外源插入片段含有未见报道的序列。