赤霞珠葡萄果实苹果酸生物合成关键转录因子的筛选与鉴定

该研究以宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄种植区栽培面积最大的‘赤霞珠’为材料,在前期完成从果实形成至成熟不同发育时期的转录组测序以及关键有机酸含量测定基础上,进一步通过转录因子结合位点预测、差异表达基因分析、加权基因共表达网络关联分析(WGCNA),逐步筛选出与‘赤霞珠’果实苹果酸生物合成相关功能基因特异结合的、影响苹果酸生物合成的相应转录因子,并对其进行qRT PCR验证,以揭示这些关键功能基因及其关键转录因子在葡萄不同种植区、果实不同发育时期存在的相互调控作用机制,为以后培育优质酿酒葡萄提供新的理论依据与思路。结果表明：(1)GC/MS分析发现, ‘赤霞珠’果实在4个发育时期的延胡索酸和苹果酸含量变化趋势基本一致,两种酸含量均从果实硬果期到绿果期逐步升至最高(3.63和626.53 μg/g),之后缓慢下降,经转色期到成熟期后逐渐降至最低(2.14和244.26 μg/g),而草酰乙酸的变化趋势却相反,在硬果期含量最高(315.54 μg/g),经绿果期、转色期到成熟期逐渐降至最低值(126.11 μg/g)。(2)‘赤霞珠’果实发育时期样本转录组测序共获得可能与苹果酸生物合成途径12种功能基因结合的转录因子6 411个,其中延胡索酸水化酶(FH)的3个功能基因有86个转录因子,苹果酸脱氢酶(MDH)的10个功能基因有717个转录因子。(3)转录组测序数据及其与有机酸含量WGCNA关联结果的Veen分析确定了‘赤霞珠’果实成熟过程中与苹果酸生物合成相关度最高的3个FH基因(VIT_14s0060g01700、VIT_13s0019g03330、VIT_07s0005g00880)、2个MDH基因(VIT_10s0003g01000、VIT_13s0019g05250)及相应的18个关键转录因子。(4)qRT PCR验证及相关性分析表明, FH基因VIT_13s0019g03330与其转录因子VIT_01s0011g06200、VIT_08s0056g01230以及MDH基因VIT_13s0019g05250与其转录因子VIT_06s0004g04960、VIT_10s0003g02070的表达水平与苹果酸的积累存在显著正相关关系,推测这4个关键转录因子可能通过调控功能基因的转录,综合影响‘赤霞珠’果实苹果酸的生物合成。     

甜菊醇糖苷生物合成关键基因的导入和鉴定分析

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）生产的甜菊醇糖苷因具有高甜度、低热能、不参与人体内代谢兼具保健功能等特点,被誉为最有发展前途的新糖源。从甜叶菊叶片克隆了甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键基因SrUGT85C2、SrUGT91D2m和SrUGT76G1,构建植物基因过量表达载体,以单独或组合的形式将这些基因导入到甜叶菊中,获得转基因植株。与野生型对照植株相比,单独导入SrUGT85C2的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量提高,总糖苷、莱包迪苷A含量及占比没有明显变化;单独导入SrUGT91D2m的转基因植株中甜菊醇单糖苷含量显著降低,而甜菊醇双糖苷含量显著增加;单独导入SrUGT76G1的转基因植株中,总糖苷含量显著提高,莱包迪苷A含量达到10%以上,比对照提高了2倍,而甜菊糖苷含量减少了一半。3个基因组合同时导入的转基因甜叶菊植株与单独导入SrUGT76G1的转基因甜叶菊植株类似,其总糖苷、莱包迪苷A含量及其占比均显著提高。这些结果为以后通过分子生物学技术来调控甜菊醇糖苷生物合成关键基因的表达,培育莱包迪苷A含量高的高品质甜叶菊新品系提供了理论依据和技术方法。