燕麦嗜酸菌鞭毛素的提纯及其活性检测

为阐明燕麦嗜酸菌(Aaa)鞭毛素作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应(PTI)的作用机理,采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析进行了蛋白提纯,并用DAB染色法对其诱导水稻产生H2O2的能力进行了测定。结果表明,上述提纯方法的组合使用有效地提纯了分子量约为45 kD的鞭毛素,经浸润接种处理后诱导了水稻叶组织H2O2的产生。因此,Aaa鞭毛素提纯蛋白可用于后续的水稻PTI机理分析。     

转异源chi基因的Bt工程菌株的生防潜力评价

【目的】构建增强抑制真菌能力兼杀虫的苏云金芽胞杆菌多功能生防菌株。【方法】将含有组成型高效表达启动子、地衣芽胞杆菌chi MY基因的重组质粒p DM,转化进杀虫活性高且有一定抑菌活性的Bt519-1菌株。酶谱分析方法确认Bt519(p DM)组成型异源表达几丁质酶。室内测定工程菌株抑菌谱,计算抑菌效率,确定最敏感的植物病原真菌,进行植物盆栽病害防治的应用潜力评价。将不同浓度的Bt粗酶液灌入甜椒幼苗根部,12 h后接种辣椒疫霉孢子液,接种2 d后开始观察,记录发病株数。自7 d起调查植株发病情况统计并分析防治效果。【结果】SDS-PAGE及酶谱分析证明,Bt519(p DM)能够特异表达68 k D蛋白,该蛋白为异源几丁质酶Chi MY。抑菌谱测定证明,工程菌抑制效率达到90%以上的有5种真菌,其中最明显的是辣椒疫霉。盆栽实验证明,Bt519(p DM)7 d的防效为73.2%。工程菌株对棉铃虫的半致死浓度(LC50)为121.26 mg/L。【结论】Bt519(p DM)是一株有应用潜力的生防菌株。     

组成型表达chi基因的Bt工程菌株构建及其特性

【目的】通过构建能够组成型高效表达几丁质酶的苏云金芽胞杆菌工程菌株,以提高其抑真菌活性。【方法】首先通过PCR扩增获得Bti75菌株chiB全长及系列缺失启动子片段,与本室构建的启动子探测型载体pCB连接,转化Bti75菌株,通过β-半乳糖苷酶活性检测及β-半乳糖苷酶mRNA的Real time-PCR检测,确定了一段长度为190 bp的组成型高效表达启动子。将这一启动子分别与Bti75自身几丁质酶基因chiA以及地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的几丁质酶基因chiMY连接构建了组成型高效表达的工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)。应用几丁质酶酶活检测、SDS-PAGE及酶谱分析检测了工程菌几丁质酶的表达情况。最后,通过检测工程菌发酵粗酶液对真菌孢子萌发和菌丝生长的影响,评估了工程菌对3种植物病原真菌的抗真菌活性。【结果】在没有诱导物存在的情况下,Bti75(pBPΔ7)菌株表达的β-半乳糖苷酶酶活和β-半乳糖苷酶mRNA的转录量分别是Bti75(pBP)菌株的7倍和2.5倍左右。在没有几丁质诱导的情况下,与野生株Bti75相比,工程菌株Bti75(pDA)和Bti75(pDM)的几丁质酶活性均提高了3.5倍左右。SDS-PAGE及酶谱分析证明目的几丁质酶在非诱导条件下达到组成型高效表达,抑真菌实验显示工程菌Bti75(pDA)和Bti75(pDM)抑制3种植物病原真菌的活性明显提高。【结论】发现190 bp的缺失启动子能够组成型高效表达不同来源的几丁质酶,无需诱导物的诱导,工程菌株就能展现良好的抗真菌能力。     

基因工程改良在昆虫病原真菌中的应用

昆虫病原真菌是自然界控制害虫种群的主要生物因子,其研究开发越来越受到重视。但由于存在致死速度慢、防效不稳定、对环境条件要求高等缺点,限制了昆虫病原真菌的应用。近年来,通过基因工程技术对昆虫病原真菌进行遗传改造,提高菌株的致病性和毒力,创造高效、稳定的工程菌株取得了较大进展。对昆虫病原真菌选择标记、遗传转化方法、基因工程改良及应用等方面最新研究进展进行了综述。