醌那霉素生物合成中间产物的一锅酶促体系研究

【目的】 通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】 纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一锅酶法进行体外反应,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测反应产物;利用该体系探究Ⅱ型硫酯酶AlpS在合成通路中的功能及作用底物;利用单一变量法对体系温度、pH、最小聚酮合酶(minimal polyketide synthase, minimal PKS)浓度和Ⅱ型硫酯酶AlpS浓度等条件进行优化。【结果】 体系所需的聚酮合酶和辅助蛋白均获得可溶性表达;利用一锅酶法成功合成了醌那霉素的早期重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin;加入AlpS蛋白后以上5种产物产量均有不同程度的提高,其中prejadomycin和dehydrorabelomycin提高较为显著;优化后的反应最适条件为:温度30℃、pH 7.0、最小聚酮合酶(AlpA、AlpB和RavC)浓度各2.8 μmol/L、AlpS 7.2 μmol/L;prejadomycin的产量提高到302 mg/L。【结论】 本研究成功利用一锅酶法在无细胞条件下重构了醌那霉素的早期生物合成途径,合成了醌那霉素的重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin。研究进一步验证了硫酯酶AlpS的链释放功能并推测其作用底物。     

天蓝色链霉菌孢子色素whiE在大肠杆菌中的异源生物合成

【目的】在大肠杆菌中完整重构孢子色素whiE的生物合成途径,分离纯化表达体系中合成的新化合物,并解析whiE的生物合成途径。【方法】构建whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI的单基因重组质粒,SDS-PAGE检测蛋白表达情况;借助Xba I与Spe I互为同尾酶的特性,实现多基因组合串联;构建好的重组质粒再导入大肠杆菌菌株BAP1中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测发酵产物;依次使用正相硅胶柱和反向半制备柱分离发酵产物,四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOFMS)鉴定发酵产物分子量。【结果】whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI均获得可溶性表达;这3个基因单个串联到菌株BTw95中均未检测到新的产物生成;而whiE-ORFII和whiE-ORFVII、 whiE-ORFI和whiE-ORFVII双基因组合以及三基因组合串联到BTw95中可检测得到两种化合物ZYC-1和ZYC-2。在负离子模式下进行Q-TOFMS检测,ZYC-1的[M-H]-为419.0748,推测分子式为C_(23)H_(16)O_8;ZYC-2的[M-H]-为465.0743,推测分子式为C_(24)H_(18)O_(10)。【结论】本研究推进了孢子色素whiE生物合成途径在大肠杆菌中的异源重构,分离鉴定了2个十二酮II型聚酮化合物,并推测了孢子色素whiE的生物合成途径。