N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的：研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法：通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBs）中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr—dN4、Adr-N4—5、Adr—N4．6、Adr—N4．7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗（pSW3891／MHBs／Adr,简称Adr）及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB／c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫．用ELISA法检测小鼠血清中抗．HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-T的脾细胞数量。结果：蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr—N4．5、Adr—N4—6、Adr-N4—7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4—5、Adr-N4—7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明：Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr—N4—5、Adr．N4—7相比无统计学差异（P〉0．05）,与Adr-dN4和Adr—N4—6组相比有显著的统计学差异（P〈0．05）。结论：在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。     

外分泌型的乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建含有组织型纤溶酶原激活剂(tPA)信号肽的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)核酸疫苗。方法将HBcAg基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入pJW4303载体中获得相应的核酸疫苗,经筛选鉴定后,用上述核酸疫苗与野生型HBcAg核酸疫苗及空载体质粒pJW4303分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测核心抗原的表达。结果成功构建以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗,体外表达证实含tPA信号肽的HBcAg在293T细胞胞内和胞外均能表达,含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗的核心抗原表达水平较高。结论以pJW4303为载体的含tPA信号肽的HBcAg核酸疫苗能够将细胞内的HBcAg分泌到细胞外,为进一步研究其免疫原性打下了基础。     

N- 糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的 表达及免疫原性的影响

目的:研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法:通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/Adr,简称Adr)及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB/c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫,用ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量。结果:蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4-5、Adr-N4-7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明:Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr-N4-5、Adr-N4-7相比无统计学差异(P>0.05),与Adr-dN4和Adr-N4-6组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。