磁珠富集法筛选大弹涂鱼CA微卫星序列

以大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)基因组DNApool为材料,构建基因组PCR文库,采用链霉亲和素包被的磁珠富集法筛选目的片段.目的片段经克隆、测序验证后获得大弹涂鱼微卫星序列.在筛选的409个菌落中共获得209个阳性克隆,其中具有144个微卫星序列(GenBank登录号为HQ852252 - HQ852395),除去重复测序和侧翼链不足的序列,可以设计引物的微卫星序列有117条.     

大黄鱼KLF6基因分子克隆和特征分析

KLF6具有抗细胞增殖的特性,在抑制肿瘤细胞方面起着重要作用.在获得KLF6基因EST序列的基础上,克隆到了KLF6基因,全长1185 bp,其中5′端198 bp,3′端333 bp,开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸.与KLF转录因子家族其它成员一样,大黄鱼KLF6的C-端含有3个连续的C2H2型锌指结构域.其氨基酸序列高度保守,与其它鱼类的同源性在90%以上.在检测的大黄鱼骨骼肌、肝脏、眼、脑、脾、心、鳃、肠和肾等9种组织中,KLF6都有不同程度的表达,其中肾、肝脏、鳃、脾脏和脑等组织中的表达量较高.KLF6表达范围的广泛性提示其在多种组织中参与细胞功能活动的调控.     

大黄鱼肝表达抗菌肽2基因的克隆和原核表达

抗菌肽是在多种细胞中表达具有抗菌活性的肽类物质的总称,在免疫反应中发挥着非常重要的作用.通过同源克隆法克隆到大黄鱼肝脏表达的抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)基因的完整开放阅读框(Opening Reading Frame,ORF).克隆到的大黄鱼LEAP-2全长2236 bp,包含外显子Ⅰ78 bp,内含子Ⅰ880 bp,外显子Ⅱ179 bp,内含子Ⅱ1044 bp,外显子Ⅲ55 bp,编码序列312 bp,编码103个氨基酸.推断的氨基酸序列羧基端区域存在高度保守的4 个半胱氨酸残基,符合LEAP-2超家族的结构特征.同源性对比后显示LEAP-2基因在进化上高度保守,大黄鱼LEAP-2推断的氨基酸序列与牙鲆、黄颡鱼、蓝色鲶鱼和斑点叉尾鮰等鱼类之间的同源性均在95%以上.将大黄鱼LEAP-2 cDNA连接到pET-32a(+),构建了重组表达质粒pET-32a-LEAP-2,将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0 mmol/L IPTG诱导表达,获得了大小约为27 kDa的重组蛋白,与预期的一致.