构建一种受hTERT启动子和miR-145双调控的更为安全的新型溶瘤腺病毒

目的:构建一种受人端粒酶逆转录酶(h TERT)启动子和mi R-145双调控的更加安全的条件复制型腺病毒。方法:在已构建的h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的条件复制型腺病毒Adzq11基础上,再将四个拷贝的mi R-145的靶序列加入到E1A的3'非翻译区,构建新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T。应用Real-time PCR测定人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HLF中mi R-145的表达量;然后在这两株细胞中,分别转染Adzq11和Adzq11-145T对应的穿梭质粒及感染病毒本身,用Real-time PCR检测E1A表达量以测定调控效果;用病毒空斑单位法检测两种病毒的复制情况;用CCK8检测对A549和HLF细胞的杀伤作用。结果:构建的新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T在HLF中复制量明显低于Adzq11,其E1A m RNA水平和杀伤效应也显著降低。而在A549中,Adzq11-145T在E1A表达、病毒复制和溶瘤能力方面较Adzq11均无显著降低。结论:成功构建出一种新的受转录和转录后水平双重调控的条件复制型腺病毒Adzq11-145T,它比仅加入h TERT启动子调控早期复制必需基因E1A的腺病毒Adzq11更加安全。     

胃癌细胞中Ras基因的表达、突变分析及新剪接型Kras△E2的发现

目的：传统Ras家族由Kras,Hras和Nras基因组成,这类基因的点突变经常在人类肿瘤中发现,突变热点位于12,13,61位密码子。ERas基因是2003年在鼠胚胎干（ES）细胞中发现的,其cDNA编码的蛋白与Kras,Hras和Nras分别有46％,43％和47％的相似性,故属于新的Ras家族成员,近几年发现ERas基因的表达与胃癌密切相关,而传统Ras基因在胃癌细胞中的表达及突变情况系统报道较少,本文旨在研究传统Ras基因Kras,Hras,Nras及其家族新成员ERas基因在胃癌细胞中的表达和突变情况。方法：选用7株不同来源不同分化程度的胃癌细胞系,利用RT—PCR及real-timePCR检测Ras基因在这些胃癌细胞系中的表达,并通过测序对传统Ras基因突变热点12,13,61位密码子及ERas基因全长进行突变分析。结果：QRas基因在这些胃癌细胞系中均有不同程度的表达,其中Hras和Nms基因在各株细胞中表达水平均一,而Kras和ERas基因则呈差异性表达;②在这些胃癌细胞中传统Ras基因突变热点12,13,61位密码子不存在突变,ERas基因全长亦未检测到突变．③发现Kras基因一新的剪接型,特点为第一、三外显子直接拼接,缺失第二外显子,命名为Kras△E2。结论：与在其他肿瘤中不同,传统Ras基因在胃癌细胞中不存在突变热点,家族新成员ERas基因全长亦无突变,在国际上首次报道新剪接型Kras△E2,从而得出创新性结论：Ras基因家族在胃癌细胞中并不是通过热点突变导致持续活化而致癌,而可能是通过ERas基因表达量的调节或形成新的剪接型KrasAE2而致癌。另外,Kras基因是一被受国际关注的肿瘤基因,新剪接型的发现可能会对Kras基因致癌机制产生新的认识,意义重大。     

hMSH6 和P53在散发性结肠癌中的表达及意义

目的:研究人类mut-s同系物6(hMSH6)和P53蛋白在散发性结肠癌(SCC)中的表达及与SCC病理特征的关系。方法:采用免疫组化Max-Vision二步法检测48例SCC癌组织、距癌灶3~9 cm的癌旁组织及≥10 cm的结肠组织以及45例正常结肠组织中hMSH6、P53的表达情况。结果:癌组织、距癌灶3~9 cm的癌旁组织中,hMSH6的阳性表达率低于距癌灶≥10 cm结肠组织及正常结肠组织,P53的阳性表达率高于距癌灶≥10 cm结肠组织及正常结肠组织,差异比较有统计学意义(P0.05);hMSH6阳性表达与癌灶部位及浸润深度有关(P0.05);P53阳性表达与组织学分级有关(P0.05);hMSH6与P53阳性表达呈负相关(r=-0.403,P0.05)。结论:hMSH6、P53的异常表达参与了SCC发生及发展的过程,hMSH6、P53可作为评价SCC生物学行为的指标。     

Neuronatin在人体常见肿瘤中的表达及对肿瘤细胞增殖的影响

目的:研究印记基因Neuronatin(NNAT)在人体常见肿瘤中的表达情况及其两种编码产物NNATα和NNATβ对肿瘤细胞增殖的影响。方法:运用组织芯片免疫组化技术对一些人体常见肿瘤及其对应正常组织中NNAT的表达进行系统检测;同时利用腺病毒载体技术,将NNATα和NNATβ分别导入人结肠癌细胞系SW620,并用实时细胞分析仪和平板克隆实验分析细胞增殖能力的变化。结果:①免疫组化结果显示:NNAT在食道鳞癌,结肠腺癌,直肠腺癌,胰腺腺癌,乳腺非特殊性浸润性导管癌,宫颈鳞癌,子宫内膜癌,膀胱移行上皮癌,肺鳞癌,皮肤鳞癌以及前列腺腺癌11种肿瘤组织,肾上腺,皮肤,睾丸,脑,骨骼肌,胰腺6种正常人体组织,以及慢性结肠黏膜炎与慢性肝炎2种炎性组织中呈阳性。②体外细胞增殖实验结果显示,NNATα对人结肠癌肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。结论:NNAT基因在多种人体肿瘤组织中表达,其α片段的表达对于结肠癌细胞系SW620增殖具有轻微抑制作用。     

表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测

采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因, 将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV, 然后用重组质粒pSNAV-Ig-BDNF转染包装细胞, 筛选出永久细胞株后, 用携带腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞, 成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病毒。经PCR鉴定该病毒含有目的基因片段, 被该病毒感染的细胞裂解液经Western blotting 证实有BDNF表达, 其培养液经ELISA检测证实含有高水平的BDNF蛋白。该病毒与小量的非复制型腺病毒Ad-null联合应用时, 其BDNF蛋白的表达水平显著提高。可弥补腺相关病毒起效慢、对细胞转导效率低的弱点, 为今后应用AAV作基因治疗提供了实验证据。     

Neuronatin对人视网膜色素上皮细胞增殖迁移的影响

目的:研究胚胎时期表达部位广泛、丰度高,而成年后分化表达的印记基因Neuronatin(Nnat)的两种剪接形式Nnatα和Nnatβ对人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖、迁移的影响。方法:构建Nnatα、β两种剪接形式的表达质粒,转染RPE获得表达该基因的稳定表达细胞株;CCK-8实验检测稳定表达细胞株的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,细胞划痕实验检测其迁移能力。结果:成功构建了Nnatα和Nnatβ表达质粒,并获得了Nnatα和Nnatβ基因稳定表达PRE细胞株。CCK-8实验结果显示cNNATα组与对照组相比较,增值率为23.33%(P0.05),cNNATβ组相较于对照组无显著性差异,细胞周期分析cNNATα组和cNNATβ组细胞在G2-S期的百分率分别为18.60%、11.11%,对照组细胞的为9.94%;相较于对照组,cNNATα组的细胞迁移能力显著增强,cNNATβ组的细胞迁移能力微弱增强。结论:Nnatα对RPE有一定的增殖作用,其影响主要在S期;同时,Nnatα显著促进RPE细胞的迁移能力。     

靶向E2F1的shRNA抑制眼内视网膜母细胞瘤生长

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)中由于Rb基因缺失或失活,转录调控因子E2F1始终处于活化状态,细胞不断增殖,E2F1活性增加是恶性肿瘤的普遍现象．根据人E2F1基因设计了3段shRNA,构建RNA干扰表达载体pSilencer-shE2F1,瞬时转染人视网膜母细胞瘤细胞株HXO-Rb-44和人肝癌细胞株SMMC-7721,通过荧光定量PCR检测E2F1表达水平的变化,PI (碘化丙锭)染色检测细胞周期各时相细胞数量以检测其对细胞周期的影响．根据筛选出的有效shRNA序列构建腺病毒载体并包装出腺病毒Ad-shE2F1,在裸鼠前房模型中,体外按50 moi的感染系数感染稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人视网膜母细胞瘤细胞株48 h后,收集细胞,将2×10⁵细胞注射到裸鼠眼前房内,连续观察眼内肿瘤细胞生长情况并拍照记录．通过转染肿瘤细胞株检测E2F1转录水平,筛选到1个能明显抑制肿瘤细胞内E2F1表达的shRNA序列,并使细胞周期中S期细胞数减少．经Ad-shE2F1感染的RB肿瘤细胞与对照相比较,其在裸鼠眼前房内肿瘤生长减缓．结果说明,有效抑制hE2F1表达的shRNA具有抑制体内外人视网膜母细胞瘤生长的作用．     

分泌睫状神经营养因子腺病毒载体的构建及小量复制病毒增强其分泌表 达的研究

目的:探讨复制型腺病毒能否增强增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF所携带外源基因的表达分泌。方法:亚克隆获得分泌型睫状神经营养因子的基因(ciliary neurotrophic factor),然后将此基因插入到穿梭质粒pshuttle。pshuttle-hCNTF经pme1酶切后,CIAP去磷酸化,利用Ad-EASY腺病毒制备系统,将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组,筛选出含目的基因的重组型腺病毒质粒的菌株,获得大量该质粒后转染病毒包装细胞AD-293,成功包装出一种血清5型增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF。结果:经PCR鉴定该病毒含有该基因片断,Western blotting证实该病毒感染细胞后能表达CNTF蛋白。采用ELISA法检测培养液证实感染细胞能高水平地分泌CNTF。结论:体外实验表明在不同滴度的复制型腺病毒Ad5-E1+E3+的带动下,该病毒感染细胞后分泌表达目的蛋白的水平显著提高,为今后应用Ad作为基因治疗的载体提供实验证据。     

表达双功能融合蛋白（sCAR-EGF）腺病毒载体的构建及其活性检测

为了提高腺病毒载体用于基因治疗的靶向性,采用PCR和体外连接的方法构建了柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackievirus-AdenovirusReceptor)胞外段sCAR和表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor)EGF融合基因,然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315。利用Ad-MAX腺病毒系统,将重组质粒pDC315-sCAR-EGF与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE13cre共同转染AD-293细胞,成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF。经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF融合基因片段,Westernblotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白。体外试验证实该病毒感染细胞所产生的融合蛋白能够引导携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞,为高水平表达EGFR的肿瘤的靶向性基因治疗提供了新的手段。     

噬菌体鸡尾酒对猕猴桃溃疡病的田间防治效果及叶际细菌群落结构的影响

【背景】噬菌体鸡尾酒可作为一种杀灭猕猴桃溃疡病病原菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae, Psa)的生物制剂,但关于噬菌体鸡尾酒在田间的防治效果和对猕猴桃植株叶际内生细菌群落结构影响的研究依然较少。【目的】探究噬菌体鸡尾酒在田间防控猕猴桃溃疡病的效果,以及噬菌体鸡尾酒对猕猴桃茎内叶际细菌微生态的影响。【方法】使用猕猴桃溃疡病病原菌感染健康植株,对比施用噬菌体鸡尾酒和传统铜制剂后溃疡病的发病情况,利用高通量测序技术分析猕猴桃叶际内生细菌群落结构的变化。【结果】与铜制剂相比,噬菌体鸡尾酒可更有效地控制猕猴桃溃疡病,改变叶际细菌群落的丰富度与多样性,增强群落结构的稳定性,改善群落物种功能基因丰度情况,一定程度使叶际细菌群落恢复至健康状态。【结论】噬菌体鸡尾酒在杀灭病原菌的同时具有良好的微生态调节功能,在猕猴桃溃疡病的生物防治中具有巨大的应用潜力。