分段DNA shuffling: 一种大分子海藻糖合酶有效的定向进化方法

[目的]红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源.为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化.[方法]M-TreS基因(M-treS)大小为2 889bp.该蛋白质分子本身具有很大的进化空间,但是却不宜进行全长基因Shuffling.分段DNA shuffling是为大分子蛋白质(基因≥2 000 bp)的进化而设计的一种方法.该方法分为三步:(1)用两对引物分别扩增目的基因的上游片段和下游片段;(2)上下游片段各自进行Shuffling; (3)利用重叠延伸PCR连接上下游突变群,建立完整基因的突变文库.[结果]结合易错PCR,通过该方法经一轮进化获得一株酶活力是野生型1.6倍、催化效率是野生型2倍的突变株.序列分析表明,该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代,其中一个来自易错突变,2个来自同源重组,3个为随机突变.[结论]分段DNA shuffling是进化大分子蛋白质的有效方法.