申克孢子丝菌STE20基因RNA干扰菌株的构建方法

目的 构建真菌通用的RNA干扰载体,以广泛用在多种真菌基因干扰的研究中。方法 利用现有的植物双元表达载体进行改造,将pBlueScriptⅡ的多克隆位点(MCS)酶切下来构建干扰载体;为使载体适于农杆菌转化,加入T-DNA边界重复序列;为便于转化后的筛选,将潮霉素抗性基因构建到干扰载体上。改造以前的干扰载体仅适于青霉菌属的RNA干扰,为扩大干扰范围,扩增pSilent-1质粒中的真菌通用启动子Ptrpc,间隔序列和终止子Ttrpc,并引入潮霉素抗性基因,使其在间隔序列两侧加上目的基因的正反向干扰序列以构建载体。结果 利用本实验构建的载体PCB309-PSUST及优化的反应体系成功实现了对孢子丝菌STE20基因的有效干扰,操作简便、转化效率高、转化子稳定。结论 成功构建的这种载体适于根癌农杆菌介导,能够对多种丝状真菌基因进行RNA干扰研究用。     

鼠伤寒沙门氏菌诱导昆明小鼠肠道感染模型的建立

目的:建立鼠伤寒沙门氏菌诱导昆明小鼠肠道感染模型。方法:先用5 mg/mL链霉素预处理2 d,提高小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性,然后正常饲养1 d,攻毒前禁水禁食4 h,再分别以不同剂量灌胃攻毒2次,间隔24 h。观察小鼠临床症状,并通过组织病理切片、透射电镜和免疫组织化学的方法,分别观察小鼠肠道组织病理变化、小肠上皮细胞超微结构变化及肠道淋巴细胞增殖状况。结果:攻毒后昆明小鼠会出现昏睡、食欲不振、寒颤,甚至死亡的现象,解剖后发现小鼠肠道充血膨胀。组织病理切片显示小鼠肠粘膜受损,小肠绒毛肿胀,排列杂乱,炎性细胞浸润;透射电镜观察超微结构显示小肠上皮细胞线粒体空泡化,嵴和膜发生融合消失,粗面内质网发生扩张;免疫组织化学的方法显示肠道感染后,淋巴结肿大,T淋巴细胞大量增殖。结论:该模型对探索鼠伤寒沙门氏菌引发肠炎的发病机制、病理生理、免疫等方面作用具有重要意义,并为特异性卵黄抗体被动免疫保护效果的后续评价奠定基础。     

一种改良的拟南芥原生质体的制备和转化方法

[目的]为了降低拟南芥原生质体制备的试验成本,缩短制备时间,降低转化所用质粒的浓度和提高转化效率。[方法]实验以胶带法为基础,比较多种普通胶带去除拟南芥叶片下表皮的效果,通过增加裂解叶片用量,设计不同质粒浓度梯度转化原生质体,调整转化过程中PEG处理时间和对原生质体进行暗培养。[结果]发现普通纸质和布质胶带去除拟南芥叶片下表皮效果良好。将叶片酶解时间缩短到20～30 min,转化质粒用量降低到5μg/6～10×104个原生质体;将PEG转化处理时间延长到30 min,利用暗培养降低了原生质体死亡率;用冰水混合物保存原生质体,24 h内不影响转化效率。[结论]改良后的胶带法制备原生质体成本低、用时短、转化效率高、可操作性强。