基于CRISPR/Cas9技术构建Plin1基因敲除小鼠模型及表型分析

利用CRISPR/Cas9技术构建纯合围脂滴蛋白(Plin1)基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型.针对Plin1基因2号外显子前后序列设计sgRNA并构建表达载体,体外转录获得sgRNA后与Cas9蛋白混合,显微注射至小鼠受精卵中并进行胚胎移植.出生小鼠经测序及PCR基因型鉴定获得Fo代阳性小鼠;令Fo代小鼠与野生型小...     

Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

构建脂肪特异性蛋白27(Fat-specific protein of 27,Fsp27)基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。“鸡尾酒”法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高(P<0.05),其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P<0.05);油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速率,其主要是通过抑制脂滴融合和增强ATGL酶的水解来完成对脂解的调控。     

下调Fsp27基因表达联合杨梅素干预对3T3-L1细胞脂解的影响

目的:下调脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因表达联合杨梅素干预,观察对3T3-L1细胞中脂质代谢的影响,并探究脂滴发生、发展变化的调控机制。方法:常规培养3T3-L1前脂肪细胞,采用"鸡尾酒"法诱导其分化为成熟脂肪细胞。脂质体法转染sh-Fsp27干扰载体,以杨梅素浓度为100μmol/L的完全培养基干预成熟脂肪细胞72h。油红O染色,观察脂滴形态及大小的变化;酶法测定细胞内甘油及甘油三酯的含量,观察细胞脂质代谢的变化。Western blot检测Fsp27、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白的表达。结果:1. 3T3-L1细胞诱导分化后,形态由纤维样变成圆形,并伴随有细胞体积的增大。2.与对照组相比,杨梅素组和转染组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P 0. 05)。与其他三组相比,联合干预组细胞中甘油三酯含量减少,甘油含量增加(P 0. 05)。3.与对照组相比,其余三组细胞内Fsp27蛋白的表达量均降低,ATGL和PPARγ的表达量升高(P 0. 05)。另外,联合干预组和杨梅素组细胞内HSL的表达量和p-p38MAPK/p38MAPK的比值均大于sh-Fsp27组和对照组(P 0. 05)。结论:1. Fsp27基因沉默与杨梅素联合干预可以更大程度地促进脂肪分解代谢。2.杨梅素可通过激活MAPK信号通路,上调HSL和ATGL的蛋白表达来发挥其促脂解的作用; sh-Fsp27干扰载体通过调节PPARγ和Fsp27蛋白的表达,增加ATGL含量来加速脂肪分解。     

CRISPR系统及其应用于小鼠的研究进展

CRISPR系统作为一种基因编辑工具,自2013年首次应用于哺乳动物以来,凭借其设计简单,耗时短,效率高的优点,在短短四年间飞速发展,其应用已经远远超过了锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶技术,并在分子生物学领域得到广泛应用。基于该系统发展而来的各项技术不断的被发掘,小鼠作为一种基本的实验动物,在CRISPR系统应用中扮演重要角色。目前基于CRISPR系统发展而来的应用工具已经成功的作用于各种体外培养的细胞,通过对胚胎细胞的编辑而产生动物模型的技术也在不断成熟,以及在疾病治疗特别是遗传病治疗中也展现出其独有的优势,并且其作用范围在不断的扩展,作用方式还在不断的创新。主要介绍CRISPR系统的结构与作用原理,讲述基因敲入、基因敲除、基因沉默、转录调控等作用于DNA的几种主要的CRISPR应用工具,针对目前主要的缺点即脱靶效应所研究出的几个改善措施,以及在小鼠疾病模型建立与疾病治疗中发挥的重要作用。     

CRISPR/Cas9敲除PLIN1基因增强3T3-L1脂肪细胞的脂解作用

应用CRISPR/Cas9技术敲除3T3-L1前脂肪细胞plin1,观察PLIN1缺失对脂肪细胞中脂肪水解的影响并探究可能机制。常规培养3T3-L1前脂肪细胞,电穿孔法转染plin1敲除载体,嘌呤霉素培养基挑选plin1敲除细胞,观察转染及筛选后的细胞存活率。"鸡尾酒"法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,酶法测定甘油和TG含量,油红O染色观察脂滴形态及数目的变化。Western blotting检测PLIN1、PPARγ、Fsp27和脂肪酶的蛋白表达;RT-PCR检测PLIN1和脂肪酶的mRNA表达。对照组细胞诱导分化后,微小脂滴数目较少,单房脂滴数目较多并围绕细胞核呈环型排列。相较于对照组,敲除组细胞诱导分化后微小脂滴数目增加,单房脂滴体积缩小,数目减少;细胞中PLIN1mRNA及蛋白表达被显著抑制(P0.05);甘油水平显著上升(0.0984±0.0076),TG含量显著下降(0.031 0±0.005 3);HSL和ATGL两种脂肪酶的mRNA及蛋白表达均升高(P0.05);PPARγ和Fsp27的表达未有明显变化。上述结果表明plin1敲除后通过暴露脂滴中脂质以及上调脂肪酶等效应增强了3T3-L1脂肪细胞的脂解作用。     

下调Perilipin 1基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响

目的:研究下调围脂滴蛋白基因(PLIN1)表达对3T3-L1细胞脂解的影响。方法:采用RNA干扰技术,构建3组阳性及1组阴性sh-PLIN1重组载体,并进行菌液PCR和DNA测序鉴定。Western blot测定PLIN1A蛋白表达,评价载体下调效果。细胞转染有效载体2天后,Bodipy 493/503染色脂滴;酶学方法测定细胞中甘油三酯和甘油含量;Western blot检测甘油三酯脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)及其磷酸化蛋白(p-HSL)的表达。酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞中环磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)的浓度。结果:各sh-PLIN1干扰载体构建成功,且3组阳性载体均能显著下调PLIN1A蛋白的表达(P0.05)。转染有效载体后,与阴性转染组相比,sh-PLIN1转染组细胞中脂滴减小,甘油三酯含量降低,甘油含量升高,ATGL和HSL相对表达量显著升高(P0.05),p-HSL相对表达量及c AMP、PKA的浓度无显著性差异(P0.05)。结论:下调PLIN1基因表达可加快3T3-L1细胞脂解速率,其可能通过上调ATGL和HSL的表达而实现,c AMP/PKA信号通路对其无明显调节作用。