CRISPR/Cas9系统在疾病模型和基因治疗中的应用北大核心CSCD

基因编辑技术的出现成功地改变了实验材料的基因序列,这为研究疾病的分子机理提供了极大的便利.然而,传统的基因编辑技术由于缺乏精确定位、随机性插入引起位置效应等原因而制约了其发展.随着规律成簇间隔短回文重复CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)/CRISPR相关核酸酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统的出现,简便高效的基因编辑技术在疾病模型的构建,损伤基因的修复和功能性基因的研究中已得到广泛应用,产生了十分重要的影响.本文就CRISPR/Cas9系统的结构特点、作用机理以及近两年来在疾病模型构建和基因治疗中的应用进行综述,以便读者了解相关领域的研究进展.     

利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响

近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用。研究表明TET2基因的缺失能够促进CAR-T细胞的快速繁殖,产生强力的CAR-T细胞。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除。首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP),并在体外酶切验证sgRNA的活性。接着利用电转染技术将Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率。最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况。基因测序与T7EⅠ酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响。流式细胞技术,CCK-8以及台盼蓝细胞活率检测结果显示缺失Tet2蛋白后,T细胞的增殖速率明显快于野生型T细胞。该研究为非病毒载体替代传统的慢病毒载体构建携带嵌合抗原T细胞奠定了基础,具有制备周期短,安全性高的特点。同时TET2缺失促进了CAR-T细胞的增殖,使其能够引发有效的抗肿瘤反应,为CAR-T细胞免疫治疗提供了新的思路。     

冷冻消融在肿瘤免疫治疗中的应用进展

冷冻消融(cryoablation)是一种肿瘤微创手术,对局部肿瘤治疗具有创伤小、治疗精准等优势,已被广泛运用在肝癌、肾癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌等实体肿瘤的治疗当中.不同于传统的放射治疗(radiation therapy)、微波射频(microwave radiofrequency)等物理治疗,冷冻消融诱发肿瘤释放...