了哥王中西瑞香素的提取分离及抗肿瘤作用研究

研究西瑞香素(daphnoretin)的体外抗肿瘤作用.采用溶剂提取法、硅胶柱层析、重结晶法从中药了哥王中分离西瑞香素并用薄层色谱法和高效液相色谱法测定纯度.应用MTT法观察不同浓度的西瑞香素对体外培养的人肺腺癌细胞AGZY-83-a、人喉癌细胞Hep2和人肝癌细胞HepG2的抑制作用.采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察细胞形态的变化并检测细胞内钙离子浓度.经紫外光谱、质谱和核磁共振光谱确定提取分离西瑞香素的结构,其纯度为99.75%.西瑞香素对体外培养的人肺腺癌细胞AGZY-83-a、人喉癌细胞Hep2和人肝癌细胞HepG2均有明显抑制作用,且呈浓度依赖性.其对上述三种肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50值分别为8.73、9.71和31.34 μg/mL.激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测结果表明应用西瑞香素处理肿瘤细胞72 h后,细胞内钙离子浓度显著升高(P<0.05).西瑞香素体外对人肺腺癌细胞AGZY-83-a、人喉癌细胞Hep2和人肝癌细胞HepG2均有明显抑制作用,机制可能与细胞内钙超载有关.     

限制性内切酶策略鉴定CRISPR/Cas9介导的Chrm3基因敲除小鼠

CRISPR/Cas9技术是近年发展起来的快速基因编辑技术。通过该技术已对多种生物的基因组进行了编辑。由此产生的基因编辑动物的建系与鉴定是随之而来较为繁琐的工作。单导向RNA(single-guide RNA, sgRNA)靶序列的设计和确定不仅影响后续靶向基因组的效率,还可作为优化鉴定、筛选方法的参考。本研究在选取sgRNA靶序列时,不仅依据软件的评分,还分析了sgRNA靶序列是否含有酶切位点,以便对后续纯合子/杂合子进行鉴定。结果显示,以特异引物扩增的野生型小鼠Chrm3基因片段可被限制性内切酶BanⅡ切为两个片段;而纯合子小鼠“丢失”该酶切位点,其PCR产物不能被切开;杂合子小鼠PCR产物被不完全切开,凝胶电泳结果可见三条带。本研究结果提示该策略可有效简化基因编辑动物建系鉴定工作,提高鉴定效率及改善阳性动物辨识效果。