ESAT6通过mTOR抑制自噬并促进BCG增殖

目的研究mTOR在结核杆菌毒力因子ESAT6诱导的自噬抑制以及促进BCG增殖中的作用。方法 PCMV-HA-ESAT6质粒转染Raw264.7细胞,用蛋白免疫印迹检测LC3、P62、P-mTOR和P-70S6K表达水平;用mTOR阻断剂Torin1联合ESAT6转染以及分别作用于Raw264.7细胞后,免疫印迹检测P62和P-mTOR表达水平,LysoTracker Red染色观察溶酶体变化,BCG增殖实验计数各组菌落数。结果 ESAT6转染细胞后,细胞P62、P-mTOR和P-70S6K表达水平显著增高,LC3I完成向LC3II的转化;联合Torin1的ESAT6转染组和Torin1处理组的P-mTOR和P62无显著变化,溶酶体无变化,BCG菌落数减少。结论 ESAT6诱导的自噬抑制和BCG的增殖依赖于mTOR的活化。     

变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因ropA的克隆及蛋白表达

克隆并表达变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因ropA。以变形链球菌UA159的耐氟菌株全基因组为模版,PCR扩增ropA基因并与p MD-18T克隆载体连接构建重组克隆质粒,测序鉴定。Bam HⅠ、HindⅢ双酶切重组克隆质粒,回收目的基因片段并与p Pro EX HTa表达载体通过粘性末端连接构建重组表达质粒,转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α,IPTG诱导,SDS-PAGE检测Rop A表达量。测序结果为变形链球菌UA159的耐氟菌株ropA基因碱基序列与亲代菌株UA159完全一致。SDS-PAGE结果显示IPTG成功诱导Rop A蛋白表达,并且随诱导时间的延长蛋白表达增多。变形链球菌UA159耐氟菌株的耐酸相关基因ropA未发生突变,说明变形链球菌耐氟菌株耐酸性增强不是由ropA碱基序列的改变导致。本研究成功诱导Rop A蛋白表达,为后续研究Rop A蛋白功能奠定了基础。