梨小食心虫谷胱甘肽S-转移酶GmolGST6的基因克隆、原核表达和酶学特征

【目的】克隆一种梨小食心虫Grapholita molesta触角中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione Stransferase,GST)基因并分析其结构特征,明确其表达特点及该基因编码蛋白的酶学特征,以期为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】根据梨小食心虫雌虫触角转录组数据,利用RT-PCR克隆梨小食心虫GST基因;通过实时荧光定量PCR测定该基因在成虫触角、头(去触角)、胸、腹、足和翅中的转录水平;利用原核表达系统和Ni离子亲和层析技术表达和纯化梨小食心虫GST重组蛋白,并对重组蛋白的稳定性和酶促动力学参数进行分析。【结果】获得了梨小食心虫谷胱甘肽S-转移酶基因GmolGST6(GenBank登录号:MF503496)的完整编码序列,开放阅读框为645 bp,编码214个氨基酸,分子量为24.21 kD,理论等电点为5.10;进化树分析和三维结构模拟表明GmolGST6属于Delta亚家族。qPCR测定结果表明,GmolGST6基因在雌雄成虫触角中高丰度表达,且在雄虫触角中的表达量显著高于雌虫。重组蛋白GmolGST6具有催化通用底物CDNB的活性,并且在pH7.5,40℃时具有最高的酶活力。重组蛋白GmolGST6的米氏常数K_m为0.21±0.06 mmol/L,最大反应速度V_(max)为14.02±1.40μmol/min·mg。【结论】根据GmolGST6的表达特点及其重组酶对模式底物CDNB的催化活性,推测在触角中高丰度表达的GmolGST6具有参与降解外源物质、保护嗅觉系统免受外源性物质毒害的功能。     

我国粘虫种群的微卫星位点筛选及遗传多样性分析

【目的】筛选适用于我国粘虫Mythimna separata种群遗传学研究的微卫星位点,从分子水平揭示粘虫种群的遗传多样性。【方法】利用已报道的微卫星标记及本实验室粘虫转录组测序的SSR序列,采用PCR产物荧光标记与自动扫描分型方法,分析各位点在我国河南、陕西、山西3个省份的7个粘虫地理种群200头试虫中的扩增稳定性和多态性。【结果】7个粘虫地理种群有7个位点能稳定扩增且具有较高的多态性。这7个位点等位基因丰富度(Ar)为4.167~12.402,观测杂合度(Ho)平均为0.640,期望杂合度(He)平均为0.752,多态信息含量(PIC)为0.547~0.884;各位点均存在无效等位基因且偏离哈迪-温伯格平衡,所有成对位点不存在显著连锁不平衡情况。【结论】从来自河南、陕西、山西的7个不同粘虫地理种群中成功筛选了7个能稳定扩增的SSR位点,且在这7个不同的粘虫地理种群中均具有较高的多态性,可用于我国粘虫种群遗传结构研究。粘虫不同地理种群间基因交流频繁,基因交流阻止了由遗传漂变引起的群体间分化,不同地理种群间遗传分化很低甚至不存在遗传分化。     

麦红吸浆虫蜕皮激素受体（EcR）基因的克隆与表达分析

为了研究蜕皮激素受体（EcR）在麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana (Géhin)滞育活动中的作用, 利用RT PCR和RACE技术克隆得到了麦红吸浆虫蜕皮激素受体基因cDNA全长, 并通过Real-time quantitative PCR研究了其表达情况。该cDNA全长序列被命名为SmEcR （GenBank登录号： KC491135）, 其开放阅读框长1 386 bp, 编码461个氨基酸残基。其蛋白预测分子量52.90 kD, 理论等电点6.24。该蛋白与其他已报道的昆虫EcR蛋白具有很高的同源性, 其中与迟眼蕈蚊Bradysia coprophila中相应蛋白的氨基酸序列一致性高达92%。SmEcR在麦红吸浆虫不同滞育时期和不同虫态中均有表达, 且在不同滞育时期、 不同虫态中的表达量差异很大。在滞育不同时期以11月表达量最高, 12月表达量最低; 在不同虫态以麦穗幼虫中的表达量较低, 而成虫中的表达水平很高。本研究为进一步明确SmEcR在麦红吸浆虫滞育调控中的作用奠定了基础。     

变温对粘虫生殖及主要能源物质代谢的影响

【目的】明确变温与粘虫Mythimna separata(Walker)生长发育和生殖的关系及变温条件下粘虫主要能源物质代谢的变化规律。【方法】将粘虫卵置于光周期均为14L∶10D,温度分别为25℃和30℃日恒温和白天30℃、夜晚20℃日变温的条件下饲养,观察记录25℃和30/20℃下的成虫产卵及卵巢管发育情况,再取30℃和30/20℃下饲养获得的3龄幼虫、6龄幼虫、蛹和1日龄成虫,测定其糖原、海藻糖和甘油三酯3种能源物质的含量及海藻糖酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶及3-羟酰辅酶A脱氢酶等4种主要能源物质代谢酶的活性。【结果】25℃与30/20℃饲养条件下相比,1日龄雌成虫卵巢管发育明显滞后,但单雌产卵量显著较多;蛹期糖原、海藻糖和甘油三酯的含量均高于3龄和6龄幼虫,成虫期各能源物质含量均较低。30/20℃日变温下粘虫体内供试3种能源物质的含量显著高于30℃日恒温(6龄幼虫和蛹期甘油三酯含量在两温度下无显著差异);温度变化对供试4种酶活性的影响差异显著。【结论】温度变化对粘虫的生长发育和繁殖具有显著的影响。在粘虫生长发育过程中以糖代谢为主;变温会加速糖代谢,减缓部分发育阶段的脂代谢,更有利能源物质的积累。     

苹褐带卷蛾成虫对主要寄主植物挥发物的触角电位反应和行为反应

【目的】苹褐带卷蛾Adoxophyes orana是危害苹果、桃、梨、枣等果树的一种重要昆虫。近年来在陕西苹果和红枣产区发生面积逐年扩大,危害日趋严重。本研究旨在明确寄主植物挥发物在苹褐带卷蛾成虫嗅觉通讯中的作用,为开发植物源引诱剂提供基础数据。【方法】利用触角电位(electroantennogram, EAG)仪测定苹褐带卷蛾2日龄未交配雌、雄成虫对51种寄主植物挥发性化合物的EAG反应;利用本实验室开发的小型蛾类昆虫嗅觉行为测试装置测定苹褐带卷蛾成虫对15种具有显著EAG反应的挥发性化合物的行为反应。【结果】EAG测试结果表明,苹褐带卷蛾成虫对不同挥发性化合物的EAG反应相对值有显著差异,雌、雄成虫对顺 3 己烯 1 醇、反 2 己烯 1 醇、1 己醇、1 庚醇、己醛、反 2 己烯醛、庚醛、辛醛、壬醛、乙酸丁酯、乙酸异戊酯和乙酸 顺 3 己烯酯的EAG反应较强。此外,雄成虫对3 甲基 1 丁醇、1 戊烯 3 醇、苯甲醛、丁酸丁酯、乙酸乙酯、三甲基巴豆酸乙酯、己酸乙酯、丙酸丁酯、异戊酸 顺 3 己烯酯、苯甲腈和柠檬腈的反应较强。在待测的51种挥发性化合物中,苹褐带卷蛾成虫对29种化合物的EAG反应具有明显性别差异,除雌虫对(-)-α-水芹烯和莰烯的EAG反应显著高于雄虫外,雌虫对其他27种挥发性化合物的EAG反应显著低于雄虫。当测试的挥发性化合物剂量在0.02~20 μg时,随剂量的增大成虫的EAG反应变化不明显;当挥发物剂量在20~200 μg时,成虫的EAG反应随剂量的增大显著升高。嗅觉行为选择试验结果表明,雌成虫对己醛、庚醛、辛醛和乙酸 顺 3 己烯酯有明显的趋性,选择率均高于58%;雄成虫对1 己醇、庚醛、乙酸异戊酯和苯甲腈有明显的趋性。【结论】苹褐带卷蛾未交配雄成虫对寄主植物挥发性化合物的EAG反应较未交配雌成虫灵敏,1 己醇、己醛、庚醛、辛醛、乙酸 顺 3 己烯酯、乙酸异戊酯和苯甲腈对苹褐带卷蛾雌蛾或雄蛾具有明显的吸引作用,可以用于开发该害虫的植物源引诱剂。