酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶通过调节细胞壁合成相关基因的表达影响细胞壁完整性

【目的】初步探讨酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Snf1/AMPK蛋白激酶影响细胞壁完整性的机制。【方法】通过同源重组交换的方法,构建酿酒酵母Snf1/AMPK蛋白激酶催化亚基的敲除菌株snf1Δ,并通过基因回补对敲除菌株表型进行验证。在含有刚果红(Congo red)和荧光增白剂(Calcofluor white)的平板上检测snf1Δ菌株细胞壁的完整性,通过q RT-PCR的方法检测snf1Δ菌株中已知的细胞壁合成相关基因的表达情况。【结果】SNF1基因敲除影响细胞壁的完整性,并影响酿酒酵母对热激应答的反应。进一步研究发现,SNF1突变菌株中β-1,3-葡聚糖合成相关基因与β-1,6-葡聚糖合成相关基因的表达量均明显降低。【结论】结果显示酿酒酵母Snf1蛋白激酶影响细胞壁的完整性,此影响发生在转录水平上,即通过调节细胞壁合成相关基因的转录来实现,揭示了Snf1蛋白的一个新角色。     

产紫杉醇真菌Pestalotiopsis microspora NK17适合遗传筛选的培养基优化

小孢拟盘多毛孢菌株NK17被证明能够产生多种具有药物开发价值的紫杉烷类似物以及冠心病治疗药物的前导物pestalotiollide B等次级代谢产物。由于是天然分离的菌株,该菌的营养要求未知,特别是缺少合适的全合成基础培养基,制约了实验室对其性状和基因水平的操作。尤其是在使用营养缺陷型菌株进行遗传转化时,全合成基础培养基是筛选工作的前提。对各种基础培养基进行筛选比较,最终确定酵母氮源加乳糖和硫酸铵的全合成基础培养基最适合NK17菌丝生长和营养缺陷型筛选。同时对该培养基的发酵产物进行了研究,成功应用该培养基进行了缺陷型回补筛选,效果较好。     

新型隐球酵母U6启动子的鉴定、克隆及功能验证

【目的】鉴定及克隆新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)中PolⅢ型的U6启动子(Cn U6启动子),并验证CnU6启动子能否有效转录shRNA及CRISPR/Cas9系统中gRNA。【方法】结合Gen Bank数据库已公布的新型隐球酵母基因组信息和本实验室RNA-seq文库数据,利用生物信息学技术分析得到新型隐球酵母中具有高转录水平的U6RNA序列。使用重叠PCR和Easy Geno方法将预测的CnU6启动子分别克隆到sh RNA及gRNA的上游区域,通过观察shRNA对靶基因的RNAi效果及gRNA引导Cas9核酸酶对靶位点的切割结果,确定CnU6启动子能否转录短RNA。【结果】CnU6启动子能够转录形成shRNA对靶基因进行沉默,并且能转录形成g RNA引导Cas9核酸酶对靶点进行切割。【结论】新型隐球酵母的CnU6启动子被成功鉴定及克隆,它能有效驱动shRNA和gRNA的转录。