黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

黑曲霉3.795glaA基因及其5'调控区的克隆和序列分析

黑曲霉Ｔ２１是由黑曲霉３．７９５经诱变育种获得的糖化酶高产菌株,为阐明其高产的分子机制,由黑曲霉３．７９５克隆了糖化酶结构基因及其５′旁侧序列,并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较．由黑曲霉３．７９５菌丝体分离染色体ＤＮＡ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,糖化酶结构基因位于～２．５ｋｂ的ＥｃｏＲⅠ－ＥｃｏＲⅤ染色体ＤＮＡ片段上,在此ＥｃｏＲⅠ位点上游约１．０ｋｂ处有一ＳａｌⅠ位点．为构建糖化酶结构基因及其５′旁侧序列的基因组文库,该染色体ＤＮＡ分别用ＥｃｏＲⅠ＋ＥｃｏＲⅤ和ＥｃｏＲ＋ＳａｌⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分离并回收长度在１．０ｋｂ左右和２．５ｋｂ左右的ＤＮＡ片段,分别与ｐＵＣ１９载体连接后转化入Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５．用原位杂交方法筛选到了携带糖化酶基因编码区及其１５０５ｂｐ５′旁侧序列的阳性克隆．对克隆片段的ＤＮＡ序列进行了测定并与黑曲霉Ｔ２１的相应序列进行了比较,结果表明,在糖化酶基因编码区及其１５０ｂｐ３′非编码区内,未发现碱基差异,但在－３４０～－１５０５的５′上游区内发生了９个位置的碱基变化,包括缺失、插入和替换．这些结果表明,黑曲霉Ｔ２１与３．７９５的糖化酶产量的差异与其结构基因无关,但可能与其     

红曲霉AS 3.3491葡萄糖淀粉酶形成的研究

对红曲霉AS3．3491供给易利用碳源,葡萄糖淀粉酶的形成受咀遏,cAMP可使之解阻遏。易利用碳源的迅速利用使培养液pH显著下降,实验发现各种提高培养液pH值的方法都能促进葡萄糖淀粉酶的形成。同时发现该菌株的五种类型的葡萄糖淀粉酶是随培养液pH的逐渐回升陆续形成的,且各型酶的出现都与培养液的一定pH值相关联。文中讨论了该菌株中葡萄糖淀粉酶形成的调控机制。     

丝状真菌基因表达系统研究进展

本文是26篇关于丝状真菌基因表达系统的研究论文的综述,包括两部份内容。前一部分叙述1979年开始建立并迅速发展起来的丝状真菌转化系统,着重介绍丝状真菌中转化系统的构建及转化的一般特点。后一部分叙述在转化系统发展基础上产生的丝状真菌基因工程,文中列出了截至1991年9月为止报道的一些成功的实例,说明它在丝状真菌工业育种和作为外源基因产物的生产和分泌系统中的应用。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

水解淀粉的酿酒酵母菌的构建

把黑曲霉糖化酶cDNA,酵母磷酸甘油激酶基因启动子区和终止区以及酵母Ty因子的δ序列构建成整合型的糖化酶表达分泌质粒pKG 1。该质粒转化酿酒酵母Y33得到整合型转化子。转化子分泌糖化酶活力在3.0μ/ml以上,在以5％可溶性淀粉为碳源的培养基中静止培养7d,淀粉利用率达86％,生成酒精的浓度与以5％葡萄糖为碳源时相等。     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.