噬菌体T7基因6.5和6.7的克隆及其缺失变种的构建

 用适当的限制性内切酶,将噬菌体T7基因6.5和6.7从整个噬菌体T7基因组中分离出来,插入到质粒pBR322中去,转化E.Coli HMS174,筛选出这两个基因的成功克隆。运用同样手段,从整个噬菌体T7基因组中分离出含有部分基因6编码序列,而不含基因6.5和6.7编码序列的T7DNA片段,插入到pBR322的衍生质粒中去,转化Ecoli C1757,再用含有基因6和基因7的双突变噬菌体T7去感染这一转化菌,通过同源交叉而得到缺失基因6.5和6.7的噬菌体T7缺失变种。这种噬菌体只能在载有噬菌体T7基因6.5和6.7,或者只载有基因6.7质粒的寄主中增殖。通过噬菌体结构蛋白电泳分析证明,这种噬菌体丢失了野生型菌体T7所具有的两条结构蛋白带。     

工程菌噬菌体T7溶菌酶的纯化和性质

用崔道珊等构建的噬菌体T7溶菌酶工程菌株,培养物经超声破碎和DE52,CM52柱层析纯化,我们得到电泳纯的T7溶菌酶,分子量为17000,最适反应pH为8.0.其热稳定性欠佳,保温37℃,5min即丧失酶活21%.     

大肠杆菌cosmid质粒的分离和DNA构型

Bolivar等u]于1977年用人工重组技术从ColEl质粒构建出声pBR322质粒,由于pBR322质粒带有两个抗药性标记,有多拷贝以及多种限制性内切酶单一切点等特性,近年来已被广泛用作重组DNA实验的载体。Collins等^[2]用pBR3222质粒与λ charon 4A的带有Cos位点的EcoRI酶切片段重组,进一步得到cosmid质粒,cosmid质拉除了具有pBR322质粒原来的优点外,它能够携带更大的外源DNA片段(40Kb),能够像λ charon 4A一样在体外进行包装,从而提高转化率。     

噬菌体T7溶菌酶工程菌的构建

将噬菌体T7溶菌酶基因克隆到含有可诱导性启动子LacUV 5的表达载体pARl206中。在没有诱导剂存在情况下,LacUV 5启动子的转录受到抑制。当带有重组质粒的转化菌生长到适当浓度,向培养液中加入0．4mmo1／L IPTG,LacUV 5启动子受到诱导,从而使插入的基因高水平表达,并积累大量具有生物活性的溶菌酶。噬菌体T 7溶菌酶在大肠杆菌中表达的产量平均约22mg／L。     

噬菌体T7溶菌酶基因的克隆

以Pbr322及含有噬菌体T7 RNA聚合酶强启动子φ10的Pbr322衍生物作为克隆载体,经限制内切酶AvaⅡ+HaeⅢ切割的一段噬菌体T7 DNA片段分别克隆到Pbr322及其衍生质粒的BamHⅠ位点上。插入的DNA片段为632碱基对。该片段包括噬菌体T7基因3．5和T7 RNA聚合酶弱启动子φ3．8的全部编码序列。已知噬菌体T7基因3．5的功能为产生噬菌体T7溶菌酶,利用氯仿处理检测带有重组质粒的转化子胞内溶菌酶活力。证明两种克隆株整体细胞中,均有溶菌酶存在。用10一20％SDS-聚丙烯酰胺凝肢电泳检查噬菌体T7基因3．5蛋白带,结果表明T7基因3．5在Pbr322衍生质粒中的表达优于Pbr322。