文冠果性别分化关键期花芽转录组分析

为探究文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)性别分化过程的分子机制,本研究对其性别分化关键期花芽进行RNA-seq分析.结果 共获得37.13 Gb原始数据,de novo组装后共产生29430条Unigenes,平均长度1144 bp,其中21887条Unigenes获得功能注释.此外,共得到差异基因4864个,其中相对于性别分化前期(Ta)差异上调基因3003个,差异下调基因1861个.GO富集分析显示,差异基因主要注释到代谢进程、植物激素信号转导、生长素激活的信号通路等功能.KEGG富集分析显示,差异基因主要注释到植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等生物功能.还筛选出6个MADS-box相关基因(TR576|c0_g1,TR7438|c0_g1,TR10037|c1_g10,TR13325|c0_g1,TR 6316|c0_g1,TR5807|c0_ g1),参与雄蕊发育、花粉管生长、花发育调节、花瓣发育、胚珠发育、转录因子活性等过程调节.RT-qPCR检测了16个基因在两个时期的表达量,结果均与RNA-seq一致.研究结果将为进行文冠果性别分化过程中基因表达分析提供参考.     

文冠果花性别分化过程中形态与解剖结构特征和气象因子分析

通过外观形态观察,结合石蜡切片技术,同时检测气象数据,研究了文冠果花性别分化过程外部形态变化、内部解剖结构以及与气象因子之间的对应关系。结果显示：（1）文冠果的雄能花和雌能花在顶、侧花序上的分布差异极显著。（2）2种花在前期的形态结构无差异;雄蕊发育包括花药壁发育和小孢子母细胞时期（20 d）、小孢子发生（11 d）,对应的外部形态分别为芽膨大至露出芽体、花序迅速伸长;雌蕊发育包括胚珠发育（30 d）、大孢子发生（11 d）,对应外部形态为花序伸长、花蕾增大至萼片开裂。（3）雄能花和雌能花在雌、雄配子体形成期出现差异;雄能花大孢子母细胞四分体时期细胞停止分裂,外观为花蕾绿色,横径2.05~4.54 mm,纵径2.99~5.32 mm,此时≥K（生物学零度）有效积温230.6 ℃;雌能花雄蕊发育异常比雄能花雌蕊发育异常出现时间晚4 d。单核花粉粒在有丝分裂期呈液泡化衰败,花蕾横径12.25~18.3 mm,纵径8.3~10.98 mm,此时≥K有效积温264 ℃。研究认为,根据花芽外部形态变化,结合气象因子数据反映花芽内部结构变化,可以判断性别分化时期。研究发现,文冠果2种花都同时具有雌雄蕊,是后期雌雄蕊发育程度不同导致性别分化,故建议从功能角度分别定义为“雌能花”和“雄能花”更准确。     

基于高通量测序的文冠果转录组分析

应用Illumina Hi-seqTM2000高通量测序技术对文冠果花芽进行转录组分析。共获得N50为1 180bp、平均长度为686bp的unigene 58 311条。与公共数据库Nr和Swiss-Prot同源性比较后发现37 047条unigene获得基因注释,另有21 264条unigene未被注释。利用COG数据库将unigene分成25类。通过GO分类和KEGG Pathway富集性分析,将unigene分别归类于55个GO term和128个代谢途径。此外,在9 794条unigene中共搜索到12 213个SSR位点,单核苷酸重复基元出现频率最高(34.95%),其次分别为二核苷酸(32.74%)和三核苷酸(28.64%)。在获得的unigene中发掘出涉及4个开花调控途径(光周期途径、春化途径、GA途径和自主途径)多个基因的同源序列。研究结果可在一定程度上解析文冠果花芽形态分化的分子调控模式与机制。     

不同分布区文冠果物候期的差异及其与地理-气候因子和结实性状的相关性

为明确文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)物候期的地理变异规律,在文冠果的主要分布区(内蒙古自治区、河北省和河南省)选择6个样地,采用定株观测方法,于2012年对文冠果的物候期进行观测,并分析了物候期与经度和纬度、气候因子和结实性状间的相关性.结果表明:在供试6个样地中,文冠果的芽萌动期、初花期、盛花期、末花期、展叶期、果速生期、果熟期、落果期、落叶期及总生长期均存在明显差异;其中,盛花期相差天数最多(40 d),果速生期相差天数最少(26 d).产自河南省三门峡市陕县(分布区南缘)的文冠果落叶期最晚,但其他各物候期均最早,总生长期最长(199 d);而产自内蒙古自治区赤峰市阿鲁科尔沁旗坤都镇(分布区北缘)的文冠果落叶期最早,但其他各物候期均最晚,总生长期最短(148 d).从结实性状看,6个样地文冠果的座果率和单位投影面积种子质量差异均较大,而种子含油率差异不明显;其中,产自河南省三门峡市陕县的文冠果座果率和单位投影面积种子质量均最低.相关性和回归分析结果表明:文冠果的大多数物候期间呈正相关,仅落叶期与其他物候期呈负相关;其中,除盛花期与果速生期无显著相关性外,花期的各物候期(初花期、盛花期和末花期)与果期的各物候期(果速生期、果熟期和落果期)均呈显著或极显著正相关.多数物候期与经度和纬度呈显著或极显著正相关,仅落叶期与经度和纬度分别呈显著和极显著负相关.总体上看,除落叶期外,文冠果各物候期与年均日照时数呈正相关,与其他气候因子多数呈负相关;其中,除果速生期和落果期外,其他物候期与年均温呈显著或极显著负相关.此外,仅总生长期与文冠果的座果率呈显著负相关,其他物候期与结实性状则无显著相关性.综合分析结果表明:文冠果的物候期呈现明显的地理变异规律,且气温是影响其物候期的主要气候因子.     

文冠果XsSCL6基因的克隆及表达分析

GRAS家族HAM亚家族（Scarecrow-like 6，SCL6）是一类植物特有的转录因子，在植物生长发育中具有关键作用。文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）是我国特有的重要林木能源植物，雄花的雌蕊败育是造成产量低的主要原因。为解析XsSCL6基因在文冠果（Xanthoceras sorbifolium Bunge）雌蕊发育中的调控作用，采用RT-PCR方法克隆文冠果4个XsSCL6同源基因，并对关键XsSCL6a蛋白进行亚细胞定位；对XsSCL6基因进行生物信息学分析，利用qRT-PCR分析XsSCL6基因在文冠果雌蕊败育过程中的表达模式。结果表明：（1）获得文冠果XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因ORF全长，分别编码751、669、717和717个氨基酸，均属于亲水不稳定蛋白。（2）文冠果XsSCL6蛋白主要由无规则卷曲和α-螺旋构成，定位于细胞核。（3）XsSCL6a、XsSCL6c和XsSCL6d均包含GRAS保守结构域， 文冠果XsSCL6蛋白和克莱门柚及甜橙的亲缘关系最近。（4）文冠果XsSCL6基因启动子中包含多种激素响应元件、植物发育相关元件。（5）qRT-PCR结果显示XsSCL6基因各个时期在雄花中的表达量显著高于雌花，表达量的趋势和转录组FPKM值一致。（6）xso-miR171和XsSCL6基因均存在裂解方式的靶向关系，TPM值和FPKM值为负相关关系。XsSCL6基因可能受到xso-miR171调控，共同参与文冠果雌蕊发育过程，对文冠果花发育具有重要作用。本研究为今后研究进一步文冠果中XsSCL6基因的功能和雌蕊败育机制提供了参考，为采用分子育种方法提高种子产量提供了理论依据。