双源CT测量前交叉韧带单束重建术后隧道位置的临床研究

目的:应用双源CT(Dual-source computer tomography,DSCT)测量前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)单束重建术后胫骨、股骨隧道位置,并对隧道位置进行评价。方法:对2013年1月至2014年6月我科收治的92例(男64例,女28例,平均年龄31.2岁)ACL单束重建患者术后膝关节进行双源CT三维重建,应用Adobe Photoshop CS6软件圈画隧道中心并采用Lorenz法测量胫骨隧道中心点相对位置百分比(Tx,Ty),采用Bernard四格表法测量股骨隧道中心点相对位置百分比(Fx,Fy)。结果:Tx平均为(54.54±3.42)%,Ty平均为(39.58±6.72)%,Fx平均为(28.98±6.51)%,Fy平均为(28.04±8.70)%。男、女性及左、右膝之间Tx、Ty、Fx、Fy的差异均无统计学意义(P0.05)。结论:双源CT能够清晰,三维显示ACL术后隧道,可以用来评估隧道位置,为改进前交叉韧带损伤后的手术方式及个体化解剖重建提供帮助。     

壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

目的：研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法：利用酶消化法消化3周龄新西兰大白兔的关节软骨,贴壁培养原代兔关节软骨细胞。购买相对分子量在5K和800K之间的八种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒（pEGFP）作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计分析不同N/P比值对不同分子量壳聚糖和质粒的结合能力及包封率的影响;纳米粒度仪、透射电子显微镜和环境扫描电子显微镜考察纳米微球的粒径分布和形态;荧光显微镜观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;流失细胞仪计算具体转染效率。结果：①N/P值为4及4以上时,各分子量的壳聚糖可完全包裹质粒成球;N/P值为2时,分子量为5K、50K、85K仅部分包裹质粒,其余可完全包裹;N/P值为1时,各壳聚糖均与质粒部分包裹;N/P值为0.25时,各壳聚糖均与质粒完全分离。②纳米粒度仪分析得出：N/P值为4时,各分子量的壳聚糖纳米微球的平均粒径均在1微米以下,③透射电子显微镜和扫描电子显微镜均可观察到球形或不规则形的大小不同的微球。荧光显微镜可大致观察到绿色荧光蛋白在软骨细胞内表达的表达情况。④流式细胞仪得出具体转染效率,分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当（差异有统计学意义,P〈0.05）。结论：与脂质体相比,N/P比值为4时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可以作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。     

生长因子TGF-β1和bFGF促兔骨髓间质干细胞向韧带样细胞分化的实验研究

摘要目的：采用生长因子TGF-β1和bFGF诱导体外培养的兔骨髓间质干细胞（MSCs）,转化为韧带样细胞,并研究此种韧带样细胞的生物特性。方法：自幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化MSCs并培养、增殖;采用特定浓度TGF-β1（10ng／ml）和bFGF（25ng／mL）对MSCs进行诱导分化,观察生长因子对MSCs生长、形态的影响,使用MTT法绘制细胞生长曲线,使用天狼腥红染色法定量对比MSCs分泌胶原蛋白量。单纯培养和单一因子诱导组作为对照。结果：TGF-β1和bFGF联合使用组,细胞形态优于空白组及单一因子组,细胞增殖率、胶原分泌量也均高于对照组。结论：联合使用生长因子TGF-β1和bFGF刺激兔MSCs,能够促使兔MSCs定向转化为韧带样细胞,对组织工程前交叉韧带的构建具有积极意义。     

壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

目的:研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力,镜下观察其大小和形态,观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法:利用酶消化法消化3周龄新西兰大白兔的关节软骨,贴壁培养原代兔关节软骨细胞。购买相对分子量在5K和800K之间的八种壳聚糖,利用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒(pEGFP)作报告基因,通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计分析不同N/P比值对不同分子量壳聚糖和质粒的结合能力及包封率的影响;纳米粒度仪、透射电子显微镜和环境扫描电子显微镜考察纳米微球的粒径分布和形态;荧光显微镜观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况;流失细胞仪计算具体转染效率。结果:①N/P值为4及4以上时,各分子量的壳聚糖可完全包裹质粒成球;N/P值为2时,分子量为5K、50K、85K仅部分包裹质粒,其余可完全包裹;N/P值为1时,各壳聚糖均与质粒部分包裹;N/P值为0.25时,各壳聚糖均与质粒完全分离。②纳米粒度仪分析得出:N/P值为4时,各分子量的壳聚糖纳米微球的平均粒径均在1微米以下,③透射电子显微镜和扫描电子显微镜均可观察到球形或不规则形的大小不同的微球。荧光显微镜可大致观察到绿色荧光蛋白在软骨细胞内表达的表达情况。④流式细胞仪得出具体转染效率,分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球,其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当(差异有统计学意义,P<0.05)。结论:与脂质体相比,N/P比值为4时,相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞,可以作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。     

双源CT三维重建前交叉韧带移植物新技术

目的:探讨双源CT(DSCT)三维重建前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)重建术后移植物的技术方法。方法:对30例ACL损伤后移植重建术后患者进行DSCT扫描,利用软件三维重建ACL移植物的三维图像,对图像效果进行分析。结果:采用设定的参数和方法,30例患者的ACL移植物均获得三维重现,其中24例获得清晰的移植物图像,6例移植物图像略模糊。结论:DSCT可以重建出移植术后ACL移植物的三维图像,对临床检验、评估重建技术、修正重建方法、实现解剖重建有重大价值。     

PHB/PLLA组织工程前交叉韧带支架材料改性的实验研究

目的:探索体外构建组织工程前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)的三维支架材料。方法:以聚羟基丁酸已酯/聚左旋乳酸(PHB/PLLA1:1)制备"三明治"样结构共聚物并测量其孔隙率等指标。以I型胶原对制备的PHB/PLLA支架进行杂化,获得PHB/PLLA胶原杂化支架。扫描电镜观察其表面结构。将兔皮肤成纤维细胞(SF)接种于PHB/PLLA支架与PHB/PLLA胶原杂化支架,观察其在材料上生长情况。结果:PHB/PLLA支架杂化后胶原填充于纤维空隙,分布比较均匀。体外培养的胶原杂化支架材料上要比PHB/PLLA支架有更多的皮肤成纤维细胞生长。结论:胶原杂化有利于细胞种植和生长,PHB/PLLA胶原杂化支架具有良好的三维构型和生物相容性,有望为前交叉韧带损伤的修复提供了一种新型的支架材料。     

皮肤成纤维细胞复合纤维修复前交叉韧带的初步研究

目的:本实验采用皮肤成纤维细胞修复原位冻融的前交叉韧带,以探索皮肤成纤维细胞作为构建组织工程前交叉韧带种子细胞的可行性.方法:体外分离培养兔皮肤成纤维细胞(SF),传代培养之后将细胞复合纤维生物蛋白胶,将细胞.纤维蛋白胶复合物植入原位冻融的前交叉韧带处.12周取材切片行HE染色及天狼猩红染色,使用偏振光显微镜观察.并使用图象分析软件对Ⅰ、Ⅲ型胶原含量进行半定量分析.结果:采用皮肤成纤维细胞复合纤维生物蛋白胶修复原位冻融的前交叉韧带的Ⅲ型胶原含量较单纯冻融的前交叉韧带明显减少,而较正常前交叉韧带则无明显统计学差异(P＞0.05).结论:皮肤成纤维细胞可作为构建组织工程前交又韧带的较为理想的种子细胞选择.     

EGF体外诱导骨髓基质干细胞增殖分化为成纤维细胞的实验研究

目的:研究表皮生长因子(EGF)在体外诱导兔骨髓基质干细胞(BMSCs)向成纤维细胞增殖分化,为韧带组织工程种子细胞提供可能的来源。方法:以EGF对体外培养的BMsCs进行诱导分化培养,相差显微镜观察细胞生长,MTT检测细胞的增殖,免疫组化半定量细胞的分化。结果:诱导后7d、14d时,诱导组呈现更均一的纤维细胞样的带有长突起的纺锤形细胞,呈束状排列,并且具有更高的细胞密度;诱导组在7d、14d细胞增殖均比对照组快;第10d时,诱导组、对照组胶原Ⅰ、Ⅲ染色均为阳性,但诱导组有更高的染色密度;诱导组、对照组胶原Ⅱ染色阴性。结论:BMSCs经。EGF。诱导后细胞增殖,并且能刺激细胞外基质的表达,基本符合肌腱和韧带组织工程的要求。