Pokemon基因敲减后Lovo细胞对DHC增殖抑制敏感性的变化

目的:观察Pokemon基因敲减后Lovo细胞对药物(dehydrocostus lactone,DHC)增殖抑制敏感性的变化。方法:构建Pokemon敲减的Lovo细胞稳定细胞株Lovo-KD,用荧光定量PCR检测Pokemon基因敲减效率,分别在Lovo-NC、Lovo-KD细胞中加入各浓度梯度的去氢木香内酯(dehydrocostus lactone,DHC),分别在24h、48h、72h用MTT法检测细胞增殖抑制效率。结果:与Lovo-NC组细胞相比,相同梯度DHC(10、15、20μg/ml)对Lovo-KD细胞24h、48h、72h的增殖抑制率均显著升高,如20μg/ml DHC作用48 h后Lovo-KD、Lovo-NC组细胞增殖抑制率分别为82.11±2.3%、28.93±2.4%,P0.01。结论:Pokemon基因敲减可增加Lovo细胞对DHC药物增殖抑制敏感性。     

应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系

[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14～16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28～32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P 0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P 0. 01。[结论]该筛选方法 28～32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。