Gln49-磷脂酶A2基因工程定点突变及酶活性分析

为了确认49位谷氨酰胺磷脂酶A2（Glutamine 49 phospholipase A2, Gln49-PLA2）酶活性缺失与氨基酸序列的相关性,对Gln49-PLA2编码基因第49位氨基酸进行PCR定点突变,利用pET32a+质粒载体在大肠杆菌中表达Gln49-磷脂酶A2的突变体--天冬氨酸磷脂酶A2（Aspartic acid 49 phospholipase A2, Asp49-PLA2--Q49D-PLA2）。将表达的包涵体蛋白变性,采用固定化金属离子亲和层析进行柱上复性、纯化获得突变体融合蛋白（fusion Q49D-PLA2--fQ49D-PLA2）;突变体融合蛋白经蛋白水解酶Factor Xa酶切后,采用Hitrap SP阳离子交换层析和Superdex 75凝胶层析进一步纯化,得到突变体蛋白Q49D-PLA2,得率为1.3%,比酶活为72U/mg。从而证实Gln49-PLA2酶活性缺失的关键原因是49位氨基酸为谷氨酰胺。