基于内源III-B型CRISPR-Cas系统构建超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii A1的基因敲降系统

【目的】亚氏火球菌(Pyrococcusyayanosii)A1菌株的最适生长温度为98°C,最适生长压力为5.2×104Pa,是研究此类严格厌氧、超嗜热和兼性嗜压古菌的环境适应性机制的良好材料。本研究基于P. yayanosii A1基因组中III-B型CRISPR-Cas系统,旨在建立可应用于此类古菌的基因表达敲降系统(geneknock-downsystem)。【方法】人工构建的mini-CRISPR簇,由内源性CRISPR簇Group1的重复序列(repeats)和待敲降的淀粉酶基因(PYCH_13690)中的原间隔序列(protospacer)组成。将该mini-CRISPR簇插入到具有辛伐他汀抗性的穿梭载体p LMOShhp中,使之转录与目的基因m RNA匹配的cr RNA,引导Cmr复合物对其进行切割。【结果】使用高静水压(HHP)诱导型启动子Phhp诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的m RNA数量在5.2×104Pa静水压时下调到原来的67.05%,在1.0×102Pa静水压时下调为原来的49.69%;而使用组成型启动子Phmtb诱导mini-CRISPR簇表达时,淀粉酶基因的m RNA数量在5.2×104Pa静水压时下调为原来的58.48%,在1.0×102Pa静水压时下调为原来的23.97%。使用鲁戈氏碘液显色法对这两类基因表达敲降突变菌株的培养物中残留的淀粉含量进行分析,结果显示突变菌株的淀粉降解能力明显降低。【结论】在P. yayanosii A1中建立了基于内源Ⅲ-B型CRISPR-Cas系统的基因敲降系统,可以用于抑制此类超嗜热嗜压古菌体内基因的表达。     

超嗜热古菌整合性遗传元件的研究进展

细菌中整合性遗传元件与DNA修饰和防御、毒力因子传播以及次级代谢等生理功能存在关联,而相关研究在超嗜热古菌中尚处于起步阶段。本文综述了超嗜热古菌中整合性病毒、质粒及基因组岛等整合性遗传元件的分类、整合及维持机制。展示了整合性遗传元件参与的水平基因转移过程在超嗜热古菌基因组演化中扮演的重要角色。整合性遗传元件相关功能基因组学研究为理解超嗜热古菌的多样性及其环境适应性机制提供了新的视角。