CREG活化ILK/VEGF促进内皮细胞血管新生

目的:探讨E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated gene,CREG)对血管内皮细胞血管新生的影响及其机制。方法:将重组腺病毒CREG载体(Ad-GFP-CREG)和腺病毒GFP载体(Ad-GFP)转染人血管内皮细胞株(vascularendothelialcell,VE),转染后细胞分别命名为ADCREG和ADGFP。内皮细胞基质胶血管形成实验观察其比较3组细胞血管发生情况。应用Western blotting测定细胞中CREG、整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表达。应用ILK激酶活性突变的质粒转染和不同浓度的VEGF中和抗体转染VE后进行细胞血管形成能力检测。结果:体内基质胶血管形成实验显示,腺病毒介导的CREG过表达显著促进VE的血管形成能力,血管密度、数量和交叉点均较对照组ADGFP和VE显著增多(P<0.01)。同时,Westernblot分析证实CREG过表达显著增加了ILK与VEGF的表达;转染ILK激酶失活质粒导致ADCREG成血管能力显著减弱(P<0.001)。应用VEGF中和抗体干预后,ADCREG细胞的成血管能力也呈现剂量依赖性下降。并且ILK激酶活性受到抑制的ADCREG细胞中VEGF表达降低。结论:CREG基因过表达通过活化ILK/VEGF信号通路促进了内皮细胞血管新生。     

CREG低表达饲养层STO细胞的建立

目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)自我更新的影响及作用机制,本研究拟通过RNA干扰方法建立CREG低表达的饲养层STO细胞,为深入研究奠定基础。方法:用Western Blot方法检测饲养层细胞系STO及ESC细胞系R1中CREG基因的表达。利用Lipofectamine 2000向STO细胞中分别转染RNA干扰空对照载体,含有无意义随机序列的对照载体以及含有4种不同CREG干扰序列的载体。用1.0μg/ml嘌呤霉素筛选1 w,荧光显微镜下挑取绿色荧光蛋白表达较高的克隆进行扩增。Western Blot方法鉴定CREG基因干扰效率,获得CREG表达最低的饲养层细胞克隆。将ESC R1接种到该克隆上,不添加白血病抑制因子,连续培养3代,用碱性磷酸酶染色判断其是否分化。结果:R1几乎不表达CREG,而STO细胞高表达CREG。Western Blot结果证实筛选到的STO克隆3A干扰效果最好,达到85%。在不添加白血病抑制因子的情况下,碱性磷酸酶染色表明R1细胞在该株饲养层细胞上连续培养3代后未见明显分化。结论:成功获得CREG低表达饲养层STO细胞,为深入探讨CREG对ESC自我更新的作用及机制奠定了基础。     

CREG基因敲除小鼠胚胎干细胞的筛选及鉴定

目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在发育过程中的作用,本研究拟通过高浓度药物筛选获得基因敲除的小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)。方法:用0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml、2.5 mg/ml及3.0 mg/ml 6个浓度的G418培养CREG杂合型(CREG其中一个等位基因被新霉素抗性neo基因替代)小鼠ESC 2周,确定最佳的G418筛选浓度。挑取该浓度下存活的ESC克隆进行扩增。将每个ESC克隆一半冻存,另一半贴壁培养。待ESC生长至80%融合后分别提取基因组DNA和蛋白。PCR方法扩增CREG基因明确基因组中是否存在CREG基因,WesternBlot方法鉴定是否有CREG蛋白表达。结果:确定2.0 mg/ml G418为最佳的筛选浓度。在该浓度下,共获得存活的克隆10个,PCR证实C2及C7克隆基因组中没有CREG基因,Western Blot证实C2及C7无CREG蛋白表达。结论:成功获得CREG基因敲除的小鼠ESC 2株,为深入研究CREG功能奠定了基础。     

过表达CREG抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨E1A激活基因阻遏子（Cellular repressor of ElA-stimulated genes,CREG）在高糖引起的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）损伤中的作用,为寻找糖尿病血管病变新的治疗靶点提供实验依据。方法：采用胶原酶消化法分离原代HUVECs,并用内皮细胞标志物CD31免疫荧光染色进行鉴定。分别用含有5．5mmol／1葡萄糖（正常糖对照组）、5．5mmol／1葡萄糖＋27．5mmol／1甘露醇（渗透压对照组）或33mmol／l葡萄糖（高糖组）的培养液培养HUVECs48h。WesternBlot检测剪切体caspase-3表达;AnnexinV／PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡。通过感染表达CREG基因的腺病毒获得CREG过表达的HUvECs,WesternBlot及流式细胞术评价CREG过表达对HUVECs凋亡的影响。结果：高糖处理48h后,HUVECs内剪切体caspase-3的蛋白表达增加,细胞凋亡率增加;过表达CREG后,高糖处理的HUVECs内剪切体Caspase-3表达和凋亡细胞比例均明显降低,但仍高于正常糖对照组。结论：CREG过表达可抑制高糖引起的HUVECs凋亡。     

CREG促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及溶酶体组织蛋白酶表达*

目的:研究E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及溶酶体组织蛋白酶表达的影响。方法:应用loss-of-function和gain-of-function模型,Lysotracker Red染色和透射电镜观察CREG对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生的影响,并通过细胞免疫荧光染色和Western blot方法,观察CREG对小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体组织蛋白酶表达的影响。结果:Lysotracker Red染色和透射电镜证实CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生;细胞免疫荧光染色和Western blot方法证实CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体组织蛋白酶cathepsin B及cathepsin S表达。结论:CREG可促进小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体发生及组织蛋白酶cathepsin B及cathepsin S表达。