日本三角涡虫热休克蛋白70(DjHSP70)C-端多肽表达及其抗血清制备

首先运用在线生物学软件对日本三角涡虫(Degusia japonica)热休克蛋白70(DjHSP70)氨基酸序列进行亲水区分析,发现该蛋白C-端含有较多亲水性氨基酸,然后以该段多肽序列为基础构建原核表达载体.采用PCR方法扩增450 bp cDNA片段,编码DjHSP70 C-端150个氨基酸多肽.将双酶切的cDNA...     

日本三角涡虫hsp70 cDNA克隆及原核表达

热休克蛋白70 是热休克蛋白家族中的重要成员, 它在保护生物体免受各种胁迫中发挥重要作用。由于其惊人的再生能力, 淡水涡虫作为研究再生和发育的模式动物受到研究者关注。但是, 有关涡虫抗逆性的分子机制却少有报道。研究采用 RACE (Rapid amplification of cDNA end) 技术首次从日本三角涡虫中克隆出hsp70 (Djhsp70)全长cDNA 序列。Djhsp70 cDNA 全长2066 bp, 含有1947 bp 的开放阅读框, 编码648 个氨基酸, 分子量71.18 kD, GenBank 登录号EU380241。DjHSP70 的氨基酸含有真核生物HSP70 家族蛋白的三个标签序列(9–16 位的IDLGTTYS、199—206 位的 DLGGGTFD、334–339 位的IVLVGG)和末端高度保守序列EEVD。经BLAST 检索分析, Djhsp70 的核苷酸序列和推定的氨基酸序列与目前已知HSP70 家族成员高度同源。有趣的是, HSP70 亲缘关系分析表明: 涡虫更靠近脊椎动物, 而与无脊椎动物果蝇和线虫相距较远。为了制备抗体研究DjHSP70 的组织学定位, 实验还成功构建了DjHSP70 表达载体, 在IPTG 诱导下表达出约76 kD 的融合蛋白。Djhsp70 cDNA 的克隆与表达载体的构建为下一步工作奠定了基础。