枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质研究及在利巴韦林酶法合成中的应用

利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶的两种基因deoD和punA,构建工程菌并采用金属螯合层析纯化PNP₇₀₂和PNP₈₁₆,酶学性质研究表明:二者具有一致的最适反应温度(60℃)和最适反应pH值(7~8),PNP₈₁₆磷酸解肌苷的催化效率(k_cat/K_m)比PNP₇₀₂高出11.12倍。底物特异性试验表明:PNP₇₀₂为高分子量的六聚体,而PNP₈₁₆为低分子量的三聚体。分别以纯化酶和工程菌菌体为酶源,以肌苷或鸟苷为核糖基供体,TCA(1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺)为底物,酶法合成核苷类抗病毒药物利巴韦林,PNP₈₁₆和工程菌XL-Blue(pPNP₈₁₆)较PNP₇₀₂和工程菌XL-Blue(pPNP₇₀₂)具有更高的催化速度和底物转化率,表明来源于微生物的低分子量的三聚体PNP在核苷类药物和中间体微生物酶法合成中具有更高的应用价值。     

假交替单胞菌XM2107嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质

【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.4.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas sp.XM2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在核苷类中间体及药物合成中的潜在应用价值。【方法】利用同源序列PCR技术从Pseudoa lteromonas sp.XM2107基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶基因,测序获得编码序列。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达以及金属螯合层析纯化,对其酶学性质进行初步研究。【结果】经过测序获得了该酶编码基因序列,全长702 bp,共编码233个氨基酸,大小为25 kDa,Genbank登录号为GQ475485。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为50℃,最适酶促反应pH为7.6(25 mmol/L磷酸盐缓冲液),最适酶促反应底物为肌苷(Km值0.389 mmol/L,37℃),且对底物腺苷和鸟苷也有磷酸解活性,在普通温度下具有较高催化活性和较好热稳定性。【结论】来源于Pseudoa lteromonas sp.XM2107的嘌呤核苷磷酸化酶在普通温度条件下具有较高的催化活性及良好热稳定性性质,在核苷类中间体和药物合成中具有较广泛的应用价值。