SIRT1过表达慢病毒稳转细胞系的构建及其对脂肪合成的影响

目的：通过油红O及BODIPY染色选取脂肪代谢理想的细胞模型,并运用高内涵仪器检测SIRT1高表达细胞系中脂肪的变化。方法：在L-02、HepG2、Huh7细胞中进行油红O和BODIPY染色,观察在不同油酸浓度下脂滴的生成情况;将构建成功的SIRT1过表达慢病毒载体GV166．SIRT1及空载体病毒GV166．Control感染L．02细胞,qPCR及Western．Blot检测感染细胞中SIRT1的表达水平;高内涵系统检测L-02SIRT1和L-02control细胞系产生的脂滴荧光强度,以确定油酸诱导的最佳浓度及最佳刺激时间。结果：通过油红O及BODIPY染色发现L-02细胞更适宜作为脂肪代谢的细胞模型;成功构建SIRT1过表达慢病毒载体GV166-SIRT1及空载体病毒GV166．Control,qPCR及Western．Blot检测显示转染病毒后SIRT1在细胞中的表达水平明显升高;在油酸刺激浓度0．4mM、诱导时间12h时,L-02SIRT1细胞中脂滴的荧光强度明显较L．02control为低。且这种差异达到最大化。结论：成功建立SIRT1过表达稳定转染细胞系,并证明高表达SIRT1能够抑制脂肪合成。     

小鼠急慢性结肠炎模型的建立及结肠上皮组织分离方法的探讨

目的:采用葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导小鼠急慢性结肠炎模型,并探讨小鼠结肠上皮组织分离技术的可行性。方法:将40只8周龄C57小鼠随机分为急性和慢性结肠炎模型DSS组和急慢和性结肠炎对照组,每组10只小鼠。急性结肠炎模型:给予C57小鼠3%DSS自由饮水7天,蒸馏水3天;慢性结肠炎模型:给予C57小鼠2.5%DSS水5天,换蒸馏水自由饮水7天,再给予2.5%DSS水5天后换蒸馏水水7天,重复3个循环,共36天,对照组蒸馏水自由饮水。期间每天观察并记录小鼠体重、便隐血、大便性状并评分。造模完成后对结肠组织行苏木素-伊红(HE)染色评价有无组织学炎性损伤。小鼠肠上皮分离采用运用机械涡旋的方法。结果:与对照组相比,小鼠急性结肠炎模型小鼠体重减轻明显(P0.001)、便隐血阳性、大便性状发生改变,结肠长度明显缩短(P0.01)。小鼠慢性结肠炎模型小鼠体重随着DSS和蒸馏水的交替出现下降和上升的变化趋势,HE染色提示急性和慢性小鼠结肠炎模型结肠上皮发生急性和慢性的炎症伤;分离得到的肠上皮组织样本提取总蛋白证实蛋白未发生降解,Actin和GAPDH内参条带清晰。结论:小鼠急性和慢性结肠炎模型的建立成功,本实验采用的小鼠结肠上皮分离方法稳定可行。     

RNA特异腺苷脱氨酶1(p150亚型)抑制肝细胞脂质合成

目的:在油酸诱导的肝细胞脂肪变模型中,检测RNA特异腺苷脱氨酶1 p150亚型(ADAR1-p150)高表达细胞系中脂肪合成的变化。方法:利用本课题组前期摸索的油酸刺激人胚胎肝细胞L-02细胞系脂肪变的条件,q RT-PCR和Western-Blot检测油酸刺激组和对照组ADAR1-p150表达变化;将构建成功的ADAR1-p150过表达慢病毒载体GV166-ADAR1-p150及空载体病毒GV166-control感染L-02细胞,检测感染细胞中ADAR1-p150的m RNA和蛋白表达水平;通过油红O染色和BODIPY染色观察L-02 ADAR1-p150和L-02 control细胞中脂滴形成,并进一步利用高内涵系统检测其荧光强度,对脂滴合成作定量分析。结果:L-02细胞在油酸刺激后ADAR1-p150的m RNA和蛋白水平降低;成功构建ADAR1-p150过表达慢病毒载体GV166-ADAR1-p150及空载体病毒GV166-control,q RT-PCR及Western-Blot检测显示病毒转染GV166-ADAR1-p150后ADAR1-p150在细胞中的表达水平显著升高;油红O染色和BODIPY染色发现L-02 ADAR1-p150较L-02 control细胞胞质中脂滴数量减少。高内涵筛选系统检测提示L-02 ADAR1-p150组中脂滴的荧光强度明显较L-02 control组低。结论:成功构建ADAR1-p150过表达稳定转染L-02细胞系,并证实高表达ADAR1-p150能够抑制脂肪合成。