核酸疫苗的特点、组成及在动物免疫中的应用

核酸疫苗是一种新型的基因工程疫苗，它将含有编码某种抗原蛋白基因序列的重组质粒作为疫苗直接导入机体细胞内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫．从而使被接种机体获得相应的免疫保护而达到防病治病的目的。就核酸疫苗的特点、组成、免疫方式、目前存在的主要问题及在动物免疫中的应用情况进行综述。  

鸡新城疫病毒抗人肿瘤性疾病的分子机制

新城疫是由鸡新城疫病毒引起的人畜共患病毒病，主要感染禽类，对人可引起发热等轻微症状。鸡新城疫病毒感染后可诱导机体产生干扰素和肿瘤坏死因子等抗肿瘤作用的细胞因子。鸡新城疫病毒的HN蛋白具有增加肿瘤细胞对淋巴细胞的粘附力、刺激淋巴细胞的分化和改变肿瘤细胞免疫原性的作用，在人类肿瘤性疾病生物防控中具有较高的研究和应用价值。  

百日咳杆菌粘附素中针对支气管败血波氏杆菌的保护性抗原肽的筛选

[目的]本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽.[方法和结果]利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其R Ⅰ和R Ⅱ区域多肽(双拷贝)的表达,命名为GST-PRN、GST-PN、GST-PC、GST-2PR Ⅰ和GST-2PR Ⅱ.Western blot检测证实5种表达产物均具有良好的反应原性.在主动免疫保护试验中,5种表达产物均能诱导小鼠产生较高的PRN抗体水平;当使用3 LD50的支气管败血波氏杆菌(Bb)强毒株HH0809进行鼻腔攻击后,GST-2PR Ⅰ的保护率为66.7%(6/9),其余4者的保护率均为100%(9/9);当使用10 LD50的HH0809攻击时,其保护率分别为77.8%(7/9)、33.3%(3/9)、66.7%(6/9)、10%(1/10)和60%(6/10).在被动免疫保护试验中,当使用10 LD50的HH0809进行腹腔攻击时,GST-2PR Ⅰ抗血清对小鼠的保护率为20%(2/10),其余4者的保护率均为100%(10/10);但经天然PRN吸附后的5种兔抗血清均无任何保护力(0/5).[结论]本研究表明PRN的N端和C端表达多肽均具有较强的针对Bb的保护力,且C端强于N端;而C端R Ⅱ区域的保护力也显著强于N端R Ⅰ区域.  

法氏囊活性五肽BP5的抗肿瘤作用

【目的】法氏囊活性五肽Bursopentin(BP5)是一种多功能生物学活性因子,不仅具有免疫调节和抗氧化功能,还具有抗肿瘤活性。目前,BP5发挥抗肿瘤生物功能的作用机制尚不清晰。【方法】本研究利用T7噬菌体展示技术构建鸡DT40细胞T7噬菌体c DNA文库,以BP5-BSA为靶分子对文库进行亲和淘选,通过序列测定和生物信息学分析,获得BP5的结合蛋白。通过分析BP5诱导的鸡DT40细胞mRNA基因表达谱和检测BP5对HCT116细胞中p53 Luciferase活性和p53信号通路中相关蛋白表达的影响来探讨BP5抗肿瘤的作用机制。【结果】构建的鸡DT40细胞T7噬菌体c DNA文库原始滴度为1.2×104pfu/m L,重组率为91.7%,扩增后滴度为1.9×109pfu/m L;通过生物淘选获得3条与BP5结合的鸡源蛋白血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和运输蛋白颗粒复合体2(trafficking protein particle complex 2)。基因表达谱分析结果显示,BP5参与调节多条与抗肿瘤功能有关的通路,其中包括p53信号通路,且p53信号通路涉及的5个差异表达基因均与细胞周期调控或抗肿瘤相关,其中SIAH1、TP53(p53)、CIP1(p21)基因被上调,CHEK2、CCNE1基因被下调。RT-PCR方法检测10个表达水平有明显变化的差异基因,其结果与基因芯片分析结果相符;BP5对p53 Luciferase活性的影响实验结果显示,BP5在0.2-20μg/m L浓度下能够明显提高HCT116细胞中p53相对Luciferase活性,Western blotting结果证实,BP5能显著促进p53、p21蛋白的表达水平,而CCNE1和CHEK2蛋白的表达水平则明显降低。【结论】本研究结果表明BP5通过p53信号通路途径发挥其抗肿瘤生物学功能,为进一步研究BP5抗肿瘤具体的分子机制提供了参考依据。  

胸腺五肽和法氏囊活性五肽的融合表达及其对禽流感灭活疫苗的佐剂效应

胸腺五肽 (TP5) 和法氏囊活性五肽 (BP5) 均具有重要的免疫学功能，但二者在基因水平上的联合应用尚未见报道。为研究TP5和BP5形成的重组融合肽TP5-BP5 (TBP5) 是否具有免疫佐剂活性，根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成重组融合肽TBP5编码序列，将其克隆至pET-32a表达载体中，重组表达载体在大肠杆菌BL21中诱导表达，并采用MTT法检测其表达产物的体外活性。同时以TBP5联合H9N2型禽流感病毒 (AIV) 灭活疫苗免疫小鼠，检测免疫后小鼠的HI抗体、HA抗体效价和细胞因子 (IL-4和IFN-γ) 的分泌水平，并通过动物攻毒试验来评价其对小鼠的免疫保护作用。结果显示，TBP5在大肠杆菌中获得表达；TBP5能显著促进小鼠胸腺T淋巴细胞和脾脏B淋巴细胞的增殖，并能增强机体免疫后HI抗体和HA抗体效价、提高细胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平，表明TBP5既能增强机体体液免疫应答，又能增强细胞免疫应答。动物免疫保护试验结果显示TBP5有助于小鼠肺脏中H9N2型AIV病毒的清除。结果表明，重组融合肽TBP5具有良好的免疫佐剂的潜能，为进一步研究开发新型疫苗佐剂奠定了基础。  

百日咳杆菌粘附素对猪源支气管败血波氏杆菌的保护性抗原的筛选

摘要：【目的】本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽。【方法和结果】利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其RI和RII区域多肽（双拷贝）的表达，命名为GST-PRN、GST-PN、GST-PC、GST-2PRI和GST-2PRII。Western blot检测证实5种表达产物均具有良好的反应原性。在主动免疫保护试验中，5种表达产物均能诱导小鼠产生较高的PRN抗体水平；当使用3 LD50的支气管败血波氏杆菌  

重组旋毛虫plancitoxin-1-like活性位点突变体蛋白的核酸酶活性

旋毛虫plancitoxin-1-like (Ts-Pt) 是旋毛虫125种DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性区域HKD基序的核酸酶，且普遍认为，组氨酸位点是DNaseⅡ的活性氨基酸位点。为研究Ts-Pt活性位点突变体蛋白的核酸酶活性，利用重叠PCR方法获得Ts-Pt活性位点突变体片段，以pET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。重组Ts-Pt突变体蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸酶酶谱分析重组Ts-Pt突变体蛋白的核酸酶活性。成功构建含Ts-Pt突变体重组质粒的基因工程菌，SDS-PAGE和亲和层析纯化结果显示，重组Ts-Pt突变体蛋白呈包涵体表达。重组蛋白经复性后并没有表现出核酸酶活性，但核酸酶酶谱分析结果显示，包涵体表达的重组Ts-Pt突变体蛋白表现出降解DNA的能力。同时，N端和C端活性位点H及HCK和DHSK突变并不影响Ts-Pt的核酸酶活性，研究结果为进一步研究庞大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛虫发育和感染方面的作用提供一定的参考。  

鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统的构建及其雏鸡免疫保护试验

摘要:【目的】为构建鼠伤寒沙门菌环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统，并对其生物学特性进行检测。【方法】以鼠伤寒沙门菌SL1344Δcya株为亲本株，利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的同源重组技术，经两步法缺失并筛选asd基因缺失株(SL1344Δcya Δasd)。将含asd基因且无抗性的pYA3493质粒电转化至缺失株SL1344ΔcyaΔasd，构建重组菌株SL1344ΔcyaΔasd (pYA3493)。【结果】试验结果表明，重组菌株SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)生化特性和生长速度与参考株SL1344相比差异较大，与亲本株SL1344Δcya基本一致，SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力，也不能分解H2 S、半乳糖和鼠李糖，但仍保留了利用葡萄糖的能力。对1日龄雏鸡攻毒试验表明，SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)毒力较参考株SL1344降低了约104倍。免疫保护试验显示，1日龄雏鸡免疫SL1344ΔcyaΔasd(pYA3493)后第17天，利用鼠伤寒沙门菌参考株攻毒，保护率为62.5%。【结论】鼠伤寒沙门菌SL1344株环化腺苷酸合成酶缺失株平衡致死系统构建成功，且具有较好的免疫保护性，为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定基础。