生殖支原体脂质相关膜蛋白激活核因子κB诱导人单核细胞表达前炎症细胞因子及凋亡

为了解生殖支原体(Mg)潜在的致病性及其脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导人单核细胞(THP-1)凋亡及表达前炎症细胞因子(CKs)的分子机制,用Mg提取的LAMPs刺激THP-1细胞,以ELISA法和RT-PCR方法分析CKs产生和其mRNA的表达。不同试实验组的细胞经AnnexinV联合PI染色后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。采用EMSA方法检测LAMPs处理的THP-1细胞中核转录因子kappaB(NF-κB)的激活,并分析NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocoarbamate,PDTC)对LAMPs处理的THP-1细胞产生CKs的量和其mRNA表达及细胞凋亡的影响。LAMPs能以时间和剂量依赖方式刺激THP-1细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-6,且能激活NF-κB诱导THP-1细胞表达CKs的mRNA及发生凋亡,PDTC能显著抑制CKs的mRNA表达水平和细胞凋亡。由于LAMPs能激活NF-κB诱导THP-1细胞表达CKs及产生细胞凋亡,因而可能是一个重要的致病因素。     

细菌对大环内酯类抗生素耐药的机制及控制策略

随着大环内酯类抗生素在临床的广泛使用,细菌对大环内酯类抗生素的耐药性日趋严重。细菌对大环内酯类药物耐药的机制,包括靶位(核糖体)的改变,细菌对大环内酯类抗生素的主动外排,细菌产生灭活大环内酯的酶等。本文就大环内酯类药物的耐药机制作一综述,并根据其耐药机制,从大环内酯类抗生素的结构修饰和主动外排抑制剂的应用等方面讨论了控制耐药性的策略。     

穿透支原体铁蛋白的原核表达、纯化及生物信息学分析

[目的]表达纯化穿透支原体(Mycoplasma penetrans)铁蛋白(Ferritin)并利用生物信息学方法分析该蛋白的生物学特性。[方法]从NCBI网站上查到Mpe Ferritin的DNA和蛋白序列,并合成Ferritin基因,设计PCR引物,以合成基因为模板扩增Ferritin片段,将其与pET15b载体连接,将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞。挑取阳性菌落,利用PCR和测序验证,提取质粒pET15b-Ferritin并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达,并使用Ni2+亲和法纯化Ferritin蛋白。然后用生物信息学方法分析Ferritin蛋白的生物学特性。[结果]Mpe Ferritin基因全长为540 bp,编码180个氨基酸。成功构建重组质粒pET15b-Ferritin,表达并纯化得到Ferritin蛋白。Ferritin蛋白定位于细胞质,无信号肽。它的α-螺旋占71.5%,β-转角占6.7%,延伸链占5.0%,无规卷曲占16.8%。由24个同源Ferritin蛋白分子组成24聚体。[结论]通过基因工程方法纯化得到Ferritin蛋白并分析了Ferritin的生物学性质。     

支原体脂质相关膜蛋白致病机制的研究进展

支原体是一种没有细胞壁的原核细胞型微生物。支原体膜表面含有丰富的脂质相关膜蛋白(Lipid-associated membrane proteins,LAMPs),LAMPs在支原体对宿主的致病过程中起着重要的作用。了解支原体LAMPs致病机制可为开发针对性疫苗和有效药物提供依据。根据近年来发表的文献,对支原体LAMPs的结构特点及其致病机制的研究进展予以综述。     

解脲脲原体脂质相关膜蛋白通过激活核因子κB调控诱导性一氧化氮合酶在小鼠巨噬细胞中的表达

为探讨解脲脲原体(Uu)的脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导小鼠巨噬细胞表达诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的分子机制,从解脲脲原体提取的脂质相关膜蛋白,刺激小鼠巨噬细胞,以RT_PCR、Western blot等方法分析iNOS的表达及NO的产生;用细胞免疫化学、间接免疫荧光及Western blot等方法检测核因子κB(NF_κB)的激活,另外检测了NF_κB的特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)和蛋白酶抑制剂放线菌酮(CHX)对iNOS的表达及NF_κB激活的影响。结果表明,解脲脲原体的LAMPs通过激活NF_κB诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS的mRNA和蛋白,且能以时间和剂量依赖方式刺激小鼠巨噬细胞产生NO,NF_κB的抑制剂PDTC或蛋白酶抑制剂放线菌酮(CHX),可抑制NF_κB的激活及iNOS的表达。由于解脲脲原体的脂质相关膜蛋白通过激活NF_κB诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS和产生NO,因而可能是一个重要的致病因素。     

穿透支原体LAMPs诱导NF-kB激活介导小鼠巨噬细胞凋亡

研究穿透支原体(Mpe)脂质相关膜蛋白(LAMPs)能否诱导小鼠巨噬细胞凋亡,并阐明其可能的分子机制,以了解Mpe潜在的致病性.用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒和DNA Ladder方法检测Mpe LAMPs诱导体外培养的小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞的凋亡.以间接免疫荧光和Western blotting方法检测经Mpe LAMPs处理的小鼠巨噬细胞NF-κB的激活和NF-kB抑制剂吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)对细胞凋亡的影响.结果表明:Mpe LAMPs能诱导小鼠巨噬细胞发生早期或晚期凋亡;Mpe LAMPs能诱导激活小鼠巨噬细胞的NF-κB,使其从细胞浆中转位到细胞核内;PDTC能显著地抑制经处理的小鼠巨噬细胞的NF-κB的激活,且能抑制Mpe LAMPs诱导的巨噬细胞发生凋亡.因此,Mpe LAMPs诱导小鼠巨噬细胞凋亡可能与NF-kB的激活有关,因而Mpe可能是一个重要的致病因素.     

结核病阳性血清特异结合蛋白的筛选与鉴定

[目的]从T7噬菌体展示的结核分枝杆菌基因组DNA文库中筛选结核病阳性血清特异结合蛋白。[方法]以饱和硫酸铵法初步纯化的结核病阳性血清为靶分子,对结核分枝杆菌基因组DNA文库进行3轮生物淘选; PCR扩增阳性噬菌体的外源DNA片段,测序后进行BLAST分析;间接ELISA和斑点免疫印迹试验检测阳性噬菌体与结核病阳性血清能否特异结合。[结果]经过3轮生物淘选,与结核病阳性血清特异结合的噬菌体得到明显富集; BLAST结果表明随机挑取的19个阳性噬菌体包括4种不同的序列,其中编码核糖激酶的序列出现次数最多;这些代表性噬菌体均能与结核病阳性血清特异结合。[结论]成功筛选到能与结核病阳性血清特异结合的4种蛋白,其中核糖激酶可能为与结核病阳性血清特异结合的优势抗原。     

利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白

从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆。检测阳性克隆LacZ报告基因的活性。提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析。结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa。用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞。经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白。从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白,为阐明MgPa的功能及Mg可能的致病机制提供参考。     

人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库的构建与鉴定

[目的]构建人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示c DNA文库,为研究人尿道上皮细胞与生殖道感染病原体的相互作用奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取SV-HUC-1细胞总RNA,分离纯化出mRNA,经反转录合成得到其双链c DNA,在双链c DNA末端加上定向的EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端,然后收集并纯化200bp以上的双链c DNA片段,连接于T7噬菌体载体,经体外包装后转入BLT5403宿主菌,T7噬菌体展示c DNA文库构建成功。[结果]将文库扩增后,用噬斑试验检测其库容,结果为1.2×106pfu/cm3。用PCR鉴定随机挑取的噬菌斑,计算其重组率达93.75%,且插入片段都大于200bp。[结论]成功构建了SV-HUC-1细胞T7噬菌体展示c DNA文库,为下一步研究泌尿生殖道感染病原体与人尿道上皮细胞的相互作用奠定了前期实验基础。     

增加革兰阴性菌外膜囊泡产量的研究进展

外膜囊泡（OMVs）是由革兰阴性菌释放的一种囊泡状结构,在革兰阴性菌的生长、感染以及与周围环境交流等过程中发挥重要作用。由于OMVs无活性、不能复制且具有良好的免疫原性,被广泛应用于新型疫苗的研究。但天然OMVs产量低,无法达到规模化生产的要求,OMVs产量提升是OMVs疫苗产业化要解决的关键核心技术问题。本文主要从细菌基因改造、生长培养条件优化和OMVs生产纯化工艺优化3个方面对提升OMVs产量的研究进行综述,以期为OMVs疫苗产业化研究开发提供参考。