幽门螺杆菌STM文库重组质粒的构建

目的:应用信号标签突变技术(Signature tagged mutagenesis,STM)构建幽门螺杆菌突变体文库重组质粒。方法:采用平末端内切酶随机酶切幽门螺杆菌基因组DNA,并回收300～500bp片段(记作Fr),基因重组技术构建重组质粒pID700-Fr,电转化E.coliDH5α筛选阳性克隆,提取重组质粒酶切鉴定。结果:成功构建了1200个幽门螺杆菌STM文库重组质粒。结论:STM技术可用于幽门螺杆菌致病以及耐药相关基因的筛选,为幽门螺杆菌致病及耐药机理的研究奠定了基础。也将为幽门螺杆菌的治疗提供新的药物靶点。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与结核分枝杆菌相互作用的研究

目的:检测LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞A549上的表达情况,及结核分枝杆菌刺激后对其表达的影响,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中所起的作用。方法:体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,在结核分枝杆菌感染A549细胞0h,24h分别提取RNA,采用RT-PCR的方法检测LC3mRNA的表达情况。采用凋亡坏死染色试剂盒在结核分枝杆菌感染24h后检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组的细胞坏死情况。在结核分枝杆菌感染A549细胞4h,8h,16,24h采用Non-Radioactive Cytocity Assay的方法检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值。结果:LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞显著表达,结核分枝杆菌感染后LC3表达降低。细胞凋亡和坏死染色结果显示空白组和3-MA组没有明显差异(P>0.05),MTB组和3-MA+MTB组有明显差异(P<0.05)。LDH检测显示MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值数据两两之间有明显差异(P<0.05)并且有时间依赖性。结论:肺泡II型上皮细胞自噬体在抵抗结核分枝杆菌的感染过程中起一定的作用。     

肺上皮细胞自噬体在结核分枝杆菌感染中保护作用的分子机制

目的：构建Atg5．真核表达载体并瞬时转染肺上皮细胞细胞株,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中保护作用的分子机制。方法：设计针对Atg5的RNAi序列,化学合成后经过变性,退火连接到pSilencerTM3．1-H1hygro真核表达载体,经测序验证其正确性。脂质体法瞬时转染真核细胞A549,免疫印迹法检测瞬时转染的效果。用结核分枝杆菌分别感染正常和自噬表达低下的A549细胞．通过检测LDH来观察细胞的坏死情况。结果：成功的构建了pSilencerTM3．1-H1hygro真核表达载体并建瞬时转染了A549细胞株,成功抑制了细胞的自噬功能。Atg5-细胞对结核杆菌的抵抗能力下降。结论：在自噬表达低下的细胞中,细胞对结核分枝杆菌的抵抗能力有明显下降。在结核分枝杆菌感染上皮细胞的过程中,自噬是一种保护机制。     

幽门螺杆菌ArsRS双组分系统基因突变株的构建

目的:构建幽门螺杆菌ArsRS双组分系统基因突变株.方法:以幽门螺杆菌标准菌株11637为模板,PCR扩增ArsS、ArsR基因;扩增产物分别克隆于载体plD700A1中,化学法转化感受态大肠杆菌E-coli DH5α,使其在细菌内同源重组,双酶切筛选得到重组载体,然后将重组载体经电转化法转化幽门螺杆菌标准菌株,获得幽门螺杆菌ArsS、ArsR突变株.结果:PCR获得了360bp、350bpArsS、ArsR基因,构建了插入ArsS、ArsR基因的重组载体pID700Al-ArsS、pID700Al-ArsR.经双酶切分析显示,所得条带与设计结果完全一致.PCR方法扩增突变株结果显示ArsS、ArsR基因已缺失.结论:成功构建了幽门螺杆菌ArsS、ArsR突变株,为ArsS、ArsR基因的检测和新型药物靶点以及疫苗的研究奠定基础.     

结核分枝杆菌eis 基因突变与氨基糖苷耐药的研究

目的:探讨结核分枝杆菌eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。方法:以本室保存的35株已确定耐一线药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素)的结核分支杆菌为研究对象,应用BECTEC960测定其二线药物(阿米卡星、卡那霉素)的耐药情况,同时应用基因测序的方法测定结核分枝杆菌eis基因突变情况,分析eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。结果:氨基糖苷耐药的部分结核分杆杆菌中,eis基因487位碱基出现突变,相应的163位氨基酸密码子由CGT突变为CAT,即由缬氨酸变为异亮氨酸。结论:eis基因V163I突变(缬氨酸变为异亮氨酸)可能与结核分枝杆菌耐氨基糖苷类药物有关。     

肺上皮细胞自噬体在结核分枝杆菌感染中保护作用的分子机制

目的:构建Atg5-真核表达载体并瞬时转染肺上皮细胞细胞株,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中保护作用的分子机制。方法:设计针对Atg5的RNAi序列,化学合成后经过变性,退火连接到pSilencerTM3.1-H1hygro真核表达载体,经测序验证其正确性。脂质体法瞬时转染真核细胞A549,免疫印迹法检测瞬时转染的效果。用结核分枝杆菌分别感染正常和自噬表达低下的A549细胞,通过检测LDH来观察细胞的坏死情况。结果:成功的构建了pSilencerTM 3.1-H1 hygro真核表达载体并建瞬时转染了A549细胞株,成功抑制了细胞的自噬功能。Atg5-细胞对结核杆菌的抵抗能力下降。结论:在自噬表达低下的细胞中,细胞对结核分枝杆菌的抵抗能力有明显下降。在结核分枝杆菌感染上皮细胞的过程中,自噬是一种保护机制。     

Toll样受体与抗真菌感染免疫

Toll样受体是一类保守的天然免疫识别受体家族,可识别众多微生物共有的保守模式分子——病原体相关分子模式,通过某些信号转导途径,激发机体先天性及获得性免疫应答,引起炎症介质的释放。数个真菌细胞壁成分可被Toll样受体识别,不同的白细胞介素1受体／Toll样受体超家族成员通过MyD88的相互作用,激活Toll样受体信号转导通路,从而诱导宿主抵抗真菌的攻击。     

结核分枝杆菌抗原Rv2389的T细胞表位的生物信息学分析

目的:分析结核分枝杆菌(MTB)抗原Rv2389的T细胞表位,确定和筛选优势表位,为研制更加有效的诊断标志物,和更安全、高效的表位疫苗奠定基础。方法:应用在线预测软件IEDB和SYFPEITHI对MTB抗原Rv2389的T细胞表位进行预测,并与ESAT-6相比较;采用SOPMA Sever软件预测其编码蛋白的二级结构;用Ex PASy在线软件预测Rv2389的三级结构,综合分析Rv2389的T细胞抗原决定簇。结果:经软件分析,Rv2389多肽预测分值普遍高于ESAT-6,Rv2389分值较高的T细胞表位区域氨基酸位于35~43、85~93、107~126和184~200。MTB抗原Rv2389蛋白无规则卷曲占71.89%,β折叠占5.53%,主要覆盖的氨基酸区域位14~23,51~67,72~112,117~127和134~212。说明这些肽段存在潜在的抗原表位优势区域的可能性;三级结构预测显示,85~93位氨基酸和107~126位氨基酸暴露于蛋白表面,是最有可能的抗原表位。结论:经生物信息学软件预测MTB抗原Rv2389有2个T细胞优势表位,即85~93位和107~126位氨基酸。     

结核分枝杆菌eis基因突变与氨基糖苷耐药的研究

目的：探讨结核分枝杆菌eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。方法：以本室保存的35株已确定耐一线药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素）的结核分支杆菌为研究对象,应用BECTEC960测定其二线药物（阿米卡星、卡那霉素）的耐药情况,同时应用基因测序的方法测定结核分枝杆菌eis基因突变情况,分析eis基因突变与氨基糖苷耐药之间的相互关系。结果：氨基糖苷耐药的部分结核分杆杆菌中,eis基因487位碱基出现突变,相应的163位氨基酸密码子由CGT突变为CAT,即由缬氨酸变为异亮氨酸。结论：eis基因V163I突变（缬氨酸变为异亮氨酸）可能与结核分枝杆菌耐氨基糖苷类药物有关。     

HPV基因分型检测在宫颈癌筛查中的应用

目的:探讨人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)基因分型技术在宫颈癌筛查中的临床应用价值。方法:采用反向斑点杂交法对HPV基因型进行分析,包括低危型(如6、11、42、43、44型等)和高危型(如16、18、31、33、35、MM4型等)共23个型别。结果:98例样本中检出HPV阳性者38例,23种基因型中共检出15种HPV型别,HPV总感染率38.8%(38/98)。慢性宫颈炎患者中HPV感染率30.4%(14/46),检测到的HPV亚型主要是HPV43,11,6,42,31和51(其中HPV6,42,31,51检出率一致)。CINI患者HPV感染率15.4%(4/26),最常见的HPV亚型为HPV35,其次为HPV16,52,53和59(其中16,52,53,59检出率一致)。CINⅡ患者HPV感染率71.4%(10/14),以HPV16,6,11,51等亚型最常见。CINⅢ患者HPV感染率75%(6/8),HPV亚型以HPV16,18,31,53为主。SCC患者HPV阳性率为100%(4/4),HPV16检测率最高,其次为HPV52,18,33,58,59和66。结论:持续的HPV感染与宫颈疾病有着密切的关系。HPV基因型的检测为临床进行宫颈疾病的筛查、诊断、治疗以及预后观察提供了较大的帮助。