日本血吸虫Sj Cyclophilin B基因的克隆、表达及免疫保护效果分析

本研究克隆和表达了日本血吸虫Cyclophilin B(Sj CyPB)编码基因的cDNA,分析其在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,评估该重组抗原在小鼠体内诱导的抗血吸虫免疫保护效果。本研究以日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增其基因全长cDNA,提交序列到NCBI,登录号为GQ403665。荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况,构建重组表达质粒,表达纯化重组蛋白。利用Western blotting检测重组蛋白的抗原性。以重组抗原免疫小鼠,评估其对小鼠诱导的免疫保护效果。结果表明,RT-PCR获得了Sj CyPB编码基因的全长cDNA,其开放阅读框为672bp。经分析确定其为CyPs家族中的CyPB基因,命名为Sj CyPB。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在18d童虫期表达量最高,32d次之。构建了重组表达质粒pGEX-6P-1-SjCyPB,并在大肠杆菌中成功表达,表达产物分子量为49.5kDa。Western blotting试验显示该重组蛋白具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得31.5%的减虫率和41.01%的肝脏减卵率。本研究获得了日本血吸虫童虫期高表达的Sj CyPB基因的全长cDNA,成功构建了Sj CyPB原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中成功表达,证实该重组抗原在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护效果。     

日本血吸虫蛋白酶体α2亚基基因的克隆、表达及功能分析

26S蛋白酶体是一种能够降解大多数内源性蛋白的多亚基复合物,它的蛋白降解作用能够影响细胞周期、转录控制和其他一些重要的细胞进程。本实验利用PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank Accession No.AY813725),序列分析表明该基因的开放阅读框(ORF)含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以包涵体形式存在,Western blotting显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,诱导产生了较高的特异性抗体水平及12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。SjPSMA2基因及其表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。     

日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达 及其功能分析

为深入研究日本血吸虫细胞凋亡机制。利用PCR技术扩增得到Sjcaspase3的全长序列,其ORF含900 bp,编码299个氨基酸,理论分子量为33 509.7 Da,理论等电点为6.39。Real-time PCR分析表明该基因在日本血吸虫生长发育的各个时期均有表达,其中21 d表达量最高,42 d雌虫表达量高于42 d雄虫。成功构建了p XJ40-FLAG-Sjcaspase3重组质粒并转染到Hela细胞内,荧光定量PCR和Western blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela细胞中表达。酶活分析提示重组Sjcaspase3具有切割特异性底物天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(DEVD)的活性。流式细胞术检测了Sjcaspase3可诱导Hela细胞发生早期细胞凋亡。研究结果为深入探讨Sjcaspase3的生物学功能及日本血吸虫细胞凋亡机制奠定了基础。     

日本血吸虫SjRAD23基因的克隆表达及基因重组抗原的免疫保护效果

辐射敏感蛋白23具有核苷酸切除修复功能,在泛素蛋白酶体途径中起到重要作用。本研究利用PCR技术克隆了日本血吸虫辐射敏感蛋白23(Sj RAD23)编码的c DNA序列,成功获得Sj RAD23的基因序列,其ORF为1 053 bp。构建Sj RAD23基因重组表达质粒p ET28a(+)-Sj RAD23,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在。利用免疫组化技术检测该蛋白在虫体的分布情况,该蛋白广泛分布在日本血吸虫虫体被膜。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫小鼠血清中检测到较高水平的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a。Western blotting分析显示重组蛋白能够被日本血吸虫成虫可溶性抗原免疫小鼠血清所识别。用重组蛋白r Sj RAD23免疫结果与206佐剂对照组比较,r Sj RAD23在BALB/c小鼠中诱导了35.94%减虫率,40.59%肝脏减卵率。结果表明Sj RAD23具有作为疫苗候选分子的潜力。