重组泛素连接酶SH2-U—box／RING的构建与表达

目的构建重组泛素连接酶SH2-U—box、SH2-RING,并克隆进入pFlag—CMV4真核表达载体,为研究靶向降解慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）患者瘤细胞中过度活化的BCR／ABL,抑制肿瘤细胞的生长提供基础。方法设计引物,扩增接头分子Grb2的SH2结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box、Cb1的RING结构域,通过重组PCR,将SH2分别与U—box、RING进行融合,融合片段双酶切之后插入真核表达载体pFlag—CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK293T细胞,Western印迹验证重组质粒的表达。结果PCR结果提示SH2-U—box条带大小888bp,SH2一RING大小为633bp,重组质粒酶切鉴定和测序结果均正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论成功构建真核重组表达载体pFlag—CMV4-SH2-U—box和pFlag—CMV4-SH2-RING,转染HEK293T细胞后能够正确表达,为后续研究奠定了基础。     

重组泛素连接酶tTRIP-U-box的构建与表达

目的：构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG—CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF（TNFReceptorAssociatedFactor）家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法：分别设计引物,扩增tTRIP（TRAF-interactingprotein）分子C端伸展的coiled．coiled结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box结构域,再利用重组PCR,将tTRlP与U-box进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG．CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK-293T细胞系,Western印迹验证重组质粒的表达。结果：PCR结果显示tTRIP截短分子和tTRIP—U-box条带大小分别为660bp和1188bp,重组质粒经酶切鉴定和测序证实正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论：成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4一tTRIP-U—box,并且转染HEK-293T细胞系后证实其能够正确表达。