组蛋白修饰对酿酒酵母复制起始相关蛋白基因表达的调控

真核生物的DNA复制是一个复杂且有序的过程,其中DNA复制起始参与调控众多生物学活动,对生物正常的生长发育具有重要作用。组蛋白修饰在调节DNA复制过程中具有重要作用。为了检测组蛋白特定位点的修饰对DNA复制起始的影响,本研究以酿酒酵母组蛋白H3/H4定点突变菌株为研究对象,采用倍比稀释表型分析法检测了组蛋白11种H3/H4甲基化、乙酰化突变菌株的生长情况,显示,以野生型菌株BY4741为对照,组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K64A、H3K56A、H3K14Q、H4K5R、H4K16Q以及组蛋白H4甲基化突变菌株H4K20Q表现为生长缺陷,其他菌株与BY4741生长情况基本一致;通过GeNorm和NormFinder软件分析得出本实验最适内参基因为β-actin;采用Real-time PCR检测了菌株细胞内复制起始相关蛋白基因mcm2、mcm10、cdc45的表达情况,表明,组蛋白H3/H4甲基化突变菌株H3K9A、H3R72K、H4K59A、H4K20Q胞内mcm2、mcm10、cdc45基因表达均显著下调(p0.01),而H4R3A胞内mcm2、mcm10表达显著上调(p0.05)、cdc45显著下调(p0.01),组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K14Q、H4K5R、H4K8A、H4K16Q胞内mcm2表达显著下调(p0.01),而在H3K64A、H3K56A胞内无显著变化,mcm10在6种组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株内表达均下调(p0.01),cdc45基因在H4K5R胞内表达无显著变化,在其余5种乙酰化突变菌株中表达均显著下调(p0.01),为进一步阐明组蛋白特定位点修饰调控DNA复制起始的深入研究提供理论帮助。     

H4K5去乙酰化对镍胁迫下酿酒酵母细胞壁完整性途径的调控作用

【目的】金属镍(nickel, Ni)是人类广泛接触的重金属污染物之一,镍暴露会激活细胞内的细胞壁完整性(cell wall integrity, CWI)信号通路,也会导致细胞内组蛋白乙酰化水平降低,但CWI途径在镍胁迫时是否受组蛋白乙酰化调控尚不完全清楚。【方法】利用组蛋白定点突变型菌株H4K5R (模拟去乙酰化状态),分析镍胁迫下H4K5去乙酰化对酿酒酵母CWI途径的调控作用【结果】与野生型菌株相比,定点突变型菌株H4K5R具有较强的镍抗性:在5.0 mmol/L NiCl₂胁迫下,定点突变型菌株仍能生长良好;Western blotting与qRT-PCR结果表明,野生型菌株BY4741在5.0 mmol/L NiCl₂胁迫下细胞壁完整性途径被激活,甘露聚糖与葡聚糖调控基因Mnn9表达量显著上调3.13倍、Fks1表达量显著上调1.49倍,甘露聚糖、β-葡聚糖的含量也增加,说明此时野生型菌株激活了CWI途径,细胞壁成分含量增加;定点突变型菌株H4K5R在5.0 mmol/L NiCl₂胁迫下CWI途径激活程度较轻,虽然Mnn9、Fks1表达量上调,但甘露聚糖含量变化并不显著,而相较于野生型菌株β-葡聚糖含量增加幅度较小。【结论】在5.0 mmol/L NiCl₂胁迫下,定点突变型菌株H4K5位点的去乙酰化调控CWI途径,进而影响细胞壁组分的变化。