细胞自噬在大鼠肺缺血/再灌注引发肝脏损伤中的作用*

目的: 探讨肺缺血/再灌注(LI/R)时肝脏损伤的影响,并初步探索细胞自噬(Autophagy)在其中发挥的作用。方法: 构建大鼠缺血/再灌注肺损伤(LI/RI)模型,模型制备方法为大鼠麻醉后切开气管进行机械通气,使用动脉夹将肺门夹闭模拟缺血过程,30 min后松开动脉夹,恢复灌注3 h。24只大鼠随机分为伪手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、溶剂组(DMSO组)和自噬抑制剂组(3-MA组),每组均6只,后2组大鼠术前分别腹腔注射DMSO和3-MA,造模结束后使用肺湿/干重比判断造模是否成功;抽取静脉血测定肝脏转氨酶指标ALT与AST;取肝脏组织,光镜下观察肝脏形态改变,以及电镜下观察肝细胞超微结构;使用RT-qPCR和Western blot实验分别检测肝脏组织细胞中自噬相关蛋白的基因mRNA表达水平和蛋白表达水平。结果: 与Sham组相比,其余各组肺湿/干重比均升高;血AST和ALT均有大幅升高且肝脏组织损伤明显,其中以I/R组升高最为明显,光镜下组织形态学及电镜下细胞微细结构均有不同程度的破坏;肝脏中自噬相关蛋白的基因表达水平与蛋白表达水平均有明显不同,表现为自噬上升 (P＜0.01或P＜0.05)。I/R组和DMSO组肝脏组织均有较重损伤,肝细胞结构破坏严重,自噬小体形成,而AST、ALT、自噬相关蛋白转录和表达水平等各项指标均无统计学差异(P＞0.05)。而相较于DMSO组,3-MA组肝脏组织损伤有所减轻,肝细胞微细结构损伤程度低,且无自噬小体形成,血中AST和ALT下降,肝脏组织内自噬水平均下降 (P＜0.05)。结论: 肺缺血/再灌注可引起大鼠肝损伤;细胞自噬可介导大鼠肺缺血/再灌注引起的肝损伤,抑制细胞自噬可以有效减轻大鼠LI/R引起的肝损伤。     

内质网过度应激在肺缺血/再灌注小鼠心肌损伤中的作用

目的：探讨内质网过度应激与肺缺血/再灌注小鼠心肌损伤的关系。方法：雄性健康SPF级C57BL/6J小鼠40只,随机将其分为4组（n=10）：假手术组（Sham组）、肺缺血/再灌注组（I/R组）、ERS通路激动剂衣霉素（TM）组、ERS通路抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）组。采用夹闭左侧肺门30 min再灌注180 min的方法制备肺缺血/再灌注损伤模型。Sham组仅行开胸处理,不夹闭肺门,机械通气210 min;TM组、4-PBA组分别于造模前30 min腹腔注射衣霉素1 mg/kg和4-苯基丁酸400 mg/kg。于再灌注180 min时眼眶取血行心肌酶检测,处死后取心肌组织,行光镜、TUNEL Caspase 3酶活性、RT-PCR和Western blot检测。结果：与Sham组比较,光镜下I/R组、TM组和4-PBA组心肌细胞均有损伤性变化,肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）活性及心肌细胞凋亡指数、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（Caspase 3）酶活性升高,p-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、Caspase 12、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）及其mRNA表达上调（P<0.01）;与I/R组比较,TM组光镜下心肌细胞损伤加重,血清CK-MB、LDH活性及心肌细胞凋亡指数、Caspase 3酶活性升高,p-JNK、Caspase 12、CHOP和GRP78蛋白及mRNA表达增加（P<0.01）,4-PBA组以上指标均下降,光镜下心肌细胞损伤减轻（P<0.01）;与TM组比较,4-PBA组光镜下心肌细胞损伤减轻,血清CK-MB、LDH活性及心肌细胞凋亡指数、Caspase 3酶活性降低,p-JNK、Caspase 12、CHOP和GRP78蛋白及mRNA表达下降（P<0.01）。结论：内质网过度应激参与肺I/R诱发的心肌损伤,抑制内质网过度应激能减轻心脏损伤。     

细胞自噬在大鼠缺血/再灌注肺损伤中的调控作用

目的: 探讨细胞自噬在大鼠缺血/再灌注肺损伤中的作用。方法: 随机将40只SD大鼠分为5组(n=8),分别为 ① 假手术组(Sham组):只开胸3.5 h;② 缺血/再灌注组(I/R组):开胸夹闭肺门缺血0.5 h后再灌注3 h;③ 溶剂组(DMSO组):术前1 h腹腔注射DMSO溶液;④自噬激动剂组(Rap组):术前腹腔注射雷帕霉素溶液;⑤自噬抑制剂组(3-MA组):术前1 h腹腔注射3-MA溶液;后三组的其余操作同I/R组。实验结束后处死大鼠,取肺组织,记录并计算肺组织湿/干重比(W/D)、总肺含水量变化(TLW) ,光镜和电镜观察肺组织及细胞形态,计算肺泡损伤率(IAR),Western blot检测自噬相关蛋白的表达情况。结果: 相对于sham组,其余四组肺W/D、TLW、IAR均明显升高,自噬相关蛋白表达明显上升,p-AMPK、Beclin 1、LC3 II 蛋白明显增多,p-mTOR、p62蛋白明显减少(P＜0.05或P＜0.01),光镜下其余各组肺组织有不同程度的水肿渗出,肺泡结构紊乱,电镜下细胞超微结构损伤加重,部分可见自噬小体;与DMSO组相比,3-MA组肺W/D、TLW、IAR明显下降(P＜0.05或P＜0.01),自噬相关蛋白表达明显下降,肺间质水肿较轻,细胞渗出较少,细胞超微结构损伤减轻,未见自噬小体。而I/R、DMSO、Rap组的各项指标变化无统计学差异(P＞0.05)。结论: 肺缺血/再灌注可诱发细胞自噬增强,从而引起大鼠肺损伤。     

siRNA沉默过度内质网应激下DⅨ基因在缺血／再灌注肺损伤中的作用

目的：探讨siRNA沉默过度内质网应激（ERS）下C．Jun氨基末端激酶（州K）通路在缺血／再灌注肺凋亡中的作用。方法：采用C57BIM6J小鼠左侧肺原位缺血／再灌注（IVR）损伤模型。实验随机分为7组（／7,=10）,包括假手术组（Sham组）,缺．tk／再灌注组（I／R组）,PBS＋Lipofectamine2000TM转染试剂组（VR＋PBS＋Lipo组）,阴性对照组（VR＋SCR组）,JNK-siRNA~g（VR＋siRNAJNl（1组、I／R＋siRNAJ眦组、I／R＋si时忱JNl。组）。各组实验结束后处死小鼠,留取左肺,分别检测肺湿干重比（W／D）和总肺水含量（TLW）;光镜观察肺组织形态结构变化,并进行肺组织损伤评估（IQA）;RT-PCR、检测JNK和葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的基因表达;Westernblot检测磷酸化JNK（p-JNK）和GRP78的蛋白表达;原位缺口末端标记法（TUNEL法）检测肺细胞凋亡指数（AU。结果：与Sham组相比,I／R＋PBS＋Lipo组和SCR组各组W／D、’ILw、IQA、JNK与GRP78mRNA和p-JNK、GRP78蛋白质表达量及AJ均明显升高（P〈0．01）,光镜显示肺组织结构出现明显损伤性变化,且各组两两比较,上述各指标均无统计学差异;与I／R＋PBS＋Lipo组和SCR组相比,JNK-siRNA各组GRP78表达水平无明显变化,余各指标均降低（P〈0．05,P〈0．01）且肺组织损伤减轻。结论：I／R引起肺组织细胞发生过度的ERS,并通过JNK通路引起细胞凋亡,损伤肺组织。     

JNK在血糖波动的糖尿病大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的:探讨血糖波动的糖尿病大鼠发生肾小管上皮细胞凋亡的信号转导机制。方法:健康SD大鼠随机分为正常对照组(A)、糖尿病稳定高血糖组(B)和糖尿病波动高血糖组(C),采用链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg腹腔注射诱发糖尿病,血糖波动组每天定时腹腔注射速效胰岛素,并错时给予葡萄糖,造成一天中血糖浓度大幅度波动模型。制模12周后,采用比色法检测肾组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,免疫组化法和Western blot检测肾脏Nox4和JNK蛋白表达,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肾脏细胞凋亡。结果:与A组比较,B组和C组肾组织MDA含量增加、SOD活性下降,肾小管上皮细胞Nox4表达增加,肾小管磷酸化JNK(P-JNK)蛋白表达上调,细胞凋亡率明显增加,且C组的以上变化均较B组更加明显(P<0.05,P<0.01)。结论:波动性高血糖较稳定性高血糖更易促进糖尿病肾小管上皮细胞凋亡,其机制与JNK信号转导通路激活有关。     

益气活血通络解毒方对小鼠肺缺血/再灌注损伤的作用及其机制

目的：探讨益气活血通络解毒方（YHTJF）对小鼠的肺部缺血/再灌注（I/R）损伤,及对I/R引起的氧化应激反应的作用。方法：成年雄性10~12周龄C57BL/6J小鼠70只,体重（21~25） g,采用在体左肺门夹闭法复制缺血/再灌注损伤模型。随机分为7组：正常对照组（C）,羧甲基纤维素钠carboxyl methyl cellulose-Na（CMC-Na）+正常对照组（CC）,羧甲基纤维素钠+假手术组（CS）,羧甲基纤维素钠+I/R模型组（CIR）,羧甲基纤维素钠+YHTJF低、中、高浓度干预组（CYL、CYM、CYH）。CN、CS、CIR组术前连续7 d腹腔注射CMC溶液,CYL、CYM、CYH组术前连续7d腹腔注射低、中、高浓度的YHTJF溶液。术毕,取左肺测定肺组织干湿比（W/D）及总肺含水量（TLW）,行肺组织损伤评估（IQA）,光镜观察肺组织形态学结构改变。TUNEL测组织细胞凋亡指数（AI）。检测血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）。结果：相比C组,CC组和CS组所有检测指标均无明显差异,CIR组的W/D、TLW、IQA、AI明显升高（P < 0.01）,肺组织形态学破坏显著;MDA含量、MPO活力明显升高,SOD活性显著降低。与CIR组比较,CYL组、CYM组、CYH组W/D、TLW、IQA、AI的表达均明显下降（P < 0.01）,组织损伤明显减轻,CYM组各项指标数值改善最明显,组织损伤最轻;3个用药组的MDA含量、MPO活力明显下降,SOD活性显著升高,其中中剂量用药组氧化应激指标变化最突出。结论：YHTJF可有效减轻小鼠缺血/再灌注性肺损伤,以中剂量效果为最佳,其机制可能与其抑制体内氧化应激反应、减轻肺组织细胞凋亡有关。