需钠弧菌WPAGA4菌株3条琼胶酶基因克隆、表达与酶学性质分析

【目的】本文拟从西太平洋深海沉积物中分离得到的需钠弧菌(Vibrio natriegens) WPAGA4菌株中克隆并表达3条β-琼胶酶基因agaW3418、agaW3419和agaW3472,并对其酶学性质进行研究。【方法】通过克隆表达技术将得到的3条琼胶酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中进行表达,通过二硝基水杨酸(DNS)法测定重组琼胶酶的酶活,并对其中活性最优的一种琼胶酶进行热稳定性和产酶条件优化。【结果】三种琼脂酶均为属于GH50家族。AgaW3418、AgaW3419和AgaW3472在温度分别为50、60和30℃以及pH值分别为6.0、7.0和7.0条件下,发挥作用的能力最强。其中琼胶酶AgaW3472表现出最优的酶活性质,在20℃下保持良好的稳定性,且在SOB (super optimal broth)培养基条件下以1%(质量体积分数)的乳糖作为碳源,同时添加20 mmol/L MgCl2,并将诱导温度和异丙基-1硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1 thio-β-D-galactoside, IPTG)浓度分别设置为37℃和0.1 mmol/L时能够获得...     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21(DE3)中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度(16℃)有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

小麦β-胡萝卜素异构酶基因定位克隆及表达分析

β-胡萝卜素异构酶(D27)是独脚金内酯(SLs)合成通路的第一个酶。该研究以普通小麦‘中国春’为材料,通过RT-PCR克隆了小麦β-胡萝卜素异构酶对应cDNA(TaD27),并对其在不同组织和低磷胁迫下的表达进行分析。结果显示:(1)克隆获得2个高度同源cDNA片段,分别定位于7A、7D染色体的长臂,命名为TaD27-7AL和TaD27-7 DL;序列分析发现,7B染色体长臂上还存在另一个同源基因TaD27-7BL。(2)3个TaD27基因均包含7个外显子,编码区长度分别为828bp(7AL)、840bp(7BL)和843bp(7DL),编码蛋白的N-端均含有叶绿体转运肽;进化分析表明,植物D27蛋白主要聚集在3个进化枝中,小麦、水稻和玉米等单子叶植物的D27高度同源,聚集在同一进化分枝。(3)组织表达分析表明,TaD27基因在叶、叶鞘和茎中的表达量较高,在幼穗中的表达量相对较低,在根中的表达量最低;低磷胁迫下,TaD27在根中的表达量先下降后升高,胁迫至6~12h时,表达量达到最低,96h时基本恢复至初始状态,而在叶中表达量则是先升高后下降,6h达到峰值,12h基本恢复到初始水平,随后表达量继续下降。