不同应变对骨髓间充质干细胞系细胞骨架影响的研究

目的:探讨不同应变对骨髓间充质干细胞系细胞骨架形态的影响。方法:实验分为六组,Ⅰ组(静态培养)、Ⅱ组(静态培养 细胞松驰素B)、Ⅲ组(10%应变12h)、Ⅳ组(10%应变12h 细胞松驰素B)、Ⅴ组(10%应变24h)、Ⅵ组(10%应变24h 细胞松驰素B)。分别对其施加10%0.5Hz的周期性应变,采用激光共聚焦显微镜技术和考马斯亮蓝染色方法对小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)细胞骨架进行形态观察、细胞F-肌动蛋白表达定量分析。结果:细胞受到不同周期性应变后,细胞的排列方向发生改变,细胞内的F-肌动蛋白排列同细胞的方向一致,随着拉伸时间的延长,F-肌动蛋白发生部分的断裂,F-肌动蛋白的荧光强度同静态组相比明显减弱(P<0.01);当加入细胞松驰素B后,细胞内F-肌动蛋白结构发生改变,在力的作用下,细胞内微丝断裂明显,随着拉伸时间的延长,微丝断裂更为加剧,F-肌动蛋白的荧光强度同静态组相比显著减弱(P<0.01)。结论:不同周期性应变对细胞微丝结构产生一定的影响,微丝在细胞感应力的响应中起重要作用。     

不同周期性应变对间充质干细胞形态变化的影响

目的探讨不同周期性应变对骨髓间充质干细胞（mesenchymal cells,MSCs）细胞形态变化的影响。方法根据应变的大小实验分为5组,Ⅰ组（静态培养）、Ⅱ组（1%应变）、Ⅲ组（3%应变）、Ⅳ组（10%应变）、Ⅴ组（15%应变）;10μg/mL细胞松弛素B（Cytochalasin B,CB）作用细胞1 h后,设相同的组进行平行实验,作用时间12 h,拉伸频率0.25 Hz;根据应变的作用时间实验分为3组,Ⅰ组（静态培养）、     

机械力对间充质干细胞向成骨细胞分化的力学响应机制研究

间充质干细胞的分化受多种因素的影响,其中力学是重要因素之一.为了探讨力学信号在间充质干细胞分化中的传导机制,利用力学加载装置在成骨细胞诱导体系条件下,对小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)加载不同拉伸应变,运用RT-PCR方法、Flou-3-AMCa2 染色技术、激光共聚焦显微镜技术及5种信号阻断剂,SB203580(p38MAPK特异抑制剂)、PD98059(MEK-1/2MAPK特异抑制剂)、LY294002(PI3Ks特异抑制剂)、细胞松弛素B(微丝结构阻断剂)、EGTA(Ca2 螯合剂),探讨力学信号的基本传导途径.结果显示:3%的拉伸应变能明显提高细胞内Ca2 水平;细胞微丝结构破坏后,延迟了3%拉伸应变对细胞内Ca2 水平增加的影响;细胞外Ca2 螯合后,拉伸应变不能促进细胞内Ca2 水平的升高,该结果提示,拉伸应变对细胞内Ca2 水平的影响主要通过细胞外Ca2 的内流实现.5种信号阻断剂能完全阻断干细胞向成骨细胞分化过程中关键基因骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和OSX mRNA的表达.p38MAPK途径、MEK-1/2MAPK途径被阻断后,拉伸应变激活了OCN和Osterix(OSX,与成骨细胞分化相关的关键基因)mRNA的表达;PI3Ks途径阻断后,拉伸应变部分激活了OCN和OSX mRNA的表达;细胞微丝破坏及胞外Ca2 螯合后,拉伸应变不能促进OCN和OSXmRNA的表达.上述结果表明:力学信号通过Ca2 信号、细胞微丝结构以及PI3Ks信号途径引起细胞的应答反应和生物学效应.     

川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

为了探讨川芎嗪体外诱导小鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞的作用,以小鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,实验分为空白对照组、β-巯基乙醇（BME）阳性对照组和川芎嗪诱导组。采用荧光免疫化学和Western blot方法,分别检测神经干细胞巢蛋白（nestin）和经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达;RT-PCR检测诱导不同时间对神经细胞相关基因Nestin、NSE、β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和核受体相关因子-1（Nurr1）mRNA表达的影响。结果显示川芎嗪诱导间充质干细胞24 h后,细胞形态发生显著改变,细胞突起形成且数目不等,形成神经元样细胞。细胞死亡率低于β-巯基乙醇诱导组。免疫荧光化学法和western blot结果显示：川芎嗪诱导后的细胞nes-tin和NSE蛋白表达呈阳性,且表达丰度显著高于β-巯基乙醇诱导组。川芎嗪作用不同时间的BMSCs表达神经细胞相关基因Nestin、β-Tubulin III、NSE和Nurrl。结果表明川芎嗪能定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,是较理想的诱导剂。     

红景天苷通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化

目的:以小鼠骨髓间充质干细胞系D1细胞为研究对象,探讨Wnt/β-catenin信号通路介导的红景天苷诱导D1细胞向神经细胞的定向分化。方法:实验分为对照组(D/F12完全培养基)和红景天苷诱导组(100μg/mL+D/F12完全培养基).将细胞分别诱导12、24、48和72 h后,采用细胞免疫荧光化学染色方法检测β-catenin和Gsk-3β的阳性细胞率。利用红景天苷分别诱导MSCs 1,2,8,12,24,48和72 h后,利用实时PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达;采用Westernblot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72 h后,β-catenin和Gsk-3β蛋白的表达;运用Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂DKK1阻断Wnt/β-catenin信号通路,Western blot方法分析红景天苷对β-catenin和NSE蛋白表达的影响。结果:红景天苷诱导24 h时β-catenin的阳性率可达55.76%,与其他组和对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),诱导24 h后Gsk-3β的阳性率与其他时间和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实时PCR检测结果显示,红景天苷诱导MSCs不同时间能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a、Ax-in2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达,诱导不同时间Wnt3a、Axin2、Lrp6和Gsk-3βmRNA的表达不尽相同。Westernblot结果表明,红景天苷诱导D1细胞12 h和24 h时β-catenin蛋白的表达明显上调,且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05);随着作用时间的延长,Gsk-3β蛋白的表达增加且差异具有统计学意义(P<0.05),阻断Wnt/β-catenin信号通路后,β-catenin和NSE蛋白的表达水平明显下调。结论:红景天苷能诱导D1细胞定向分化为神经元样细胞,红景天苷通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现其诱导MSCs向神经细胞定向分化。     

核受体辅助因子及其信号转导

类固醇激素、核受体及其辅助因子在细胞增殖、分化中起重要的作用。核受体与相应的配体结合后同细胞内的辅助激活因子ＣＢＰ／Ｐ３００、ＰＣＡＦ、Ｐ／ＣＩＰ和ＳＲＣ家族等结合形成的复合物能使组蛋白乙酰化促进基因的转录,当缺乏配体时核受体同辅助抑制因子ＳＭＲＩ、mSin3A及ＨＡＤ１具有很强的结合力使组蛋白去乙酰化抑制基因的转录活性。ＭＡＰＫ、ＰＫＡ、ＡＰ－１、Ｓap-a、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＪＡＫ信号传导中核受体辅助因子参与信号传导过程影响基础的转录。     

Ⅰ型胶原/聚己内酯/凹凸棒石复合支架材料体外诱导成骨的研究

目的:研究Ⅰ型胶原(ColⅠ)/聚己内酯(PCL)/凹凸棒石(ATP)复合支架材料的生物相容性及体外骨诱导性。方法:采用溶液浇铸-粒子滤沥法制备三种不同ATP含量(0% wt、10% wt、30% wt)的ColⅠ/PCL/ATP复合支架材料;将D1细胞与三种支架材料共培养,扫描电镜、鬼笔环肽和H&E染色、CCK-8法评价支架材料的生物相容性;D1细胞复合三种支架材料培养7天、14天、21天后RT-qPCR检测其成骨相关基因(Runx-2、Osterix、ALP、Col I、OPN、OC)的相对表达量,分别评价比较三种支架材料的成骨诱导效应。结果:SEM、鬼笔环肽和H&E染色显示D1细胞在三种支架材料表面均呈现良好的黏附;CCK-8结果显示,细胞在ATP含量30% wt的支架材料上增殖率显著高于其他两组,RT-qPCR检测结果显示,与0% wt、10% wt ATP相比,30% wt ATP组的Runx-2相对表达量在7天时显著升高, 14天、21天降低;ALP相对表达量在14天时显著升高,21天时显著降低;Osterix、Col I、OPN、OC的相对表达量随时间和ATP剂量的增加显著上调(P<0.05)。结论:ColⅠ/PCL/ATP复合支架材料具有良好的生物相容性及骨诱导性,有望成为一种理想的骨组织工程支架材料。