哺乳期过度喂养对幼鼠肥胖和肠道菌群结构的影响

目的 研究哺乳期过度喂养对幼鼠肠道细菌组成的影响以及肠道细菌与哺乳期过度喂养导致的幼年肥胖的相关性.方法 将正常出生体重的4日龄雄性ICR仔鼠分为正常喂养组(NF组,每8只由1只母鼠喂养)和哺乳期过度喂养组(OF组,每4只由1只母鼠喂养),哺乳至3周龄时,对仔鼠进行口服糖耐量试验(OGTT),称量体重、各种器官和脂肪组织的重量,用基于细菌16S rRNA基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)和实时定量PCR分析仔鼠的粪便细菌组成,对细菌类群数量与表型数据进行相关分析.结果 OF组仔鼠从10日龄起体重显著高于NF组,3周龄时附睾和肾周脂肪垫重量显著高于NF组,两组仔鼠的空腹血糖以及OGTT血糖曲线下面积比较差异无统计学意义.对DGGE图谱的主成分分析表明两组仔鼠的菌群结构比较差异有统计学意义.定量PCR显示,OF组仔鼠粪便中产生内毒素的肠杆菌科细菌和产生破坏肠屏障功能的H2S的硫酸盐还原菌的数量显著高于NF组,而双歧杆菌、乳杆菌和丁酸盐产生菌的数量在两组仔鼠之间差异无统计学意义.粪便硫酸盐还原菌的数量与内脏脂肪的重量显著正相关.结论 哺乳期过度喂养增加了肠道中肠杆菌科细菌和硫酸盐还原菌的数量,这些细菌的增加与仔鼠幼年期肥胖相关.     

人肠道内Faecalibacterium prausnitzii的分离、鉴定及优良菌株筛选研究

本研究通过特异性引物PCR、ERIC-PCR指纹图谱,从一健康人体肠道内筛选到20种ERIC类型的分离物。选取不同ERIC类型的代表菌株进行16S r RNA全长基因测序并在NCBI中进行BLAST,发现15种代表菌株的16S r RNA基因序列与库中的普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)相似性均达到97%以上,初步将这些代表菌株鉴定为普拉梭菌。为了筛选出与人体健康具有密切相关性且生物学活性强的优良菌株,通过综合分析15种ERIC类型的分离物的分离丰度及遗传距离,从鉴定出的15株代表菌株中挑选了7株候选优良菌株,进行胆汁酸盐耐受、丁酸盐产生和对肠屏障功能的障影响等评价。研究表明:胆汁酸盐浓度高于0.1%时,F18、F22、F109和F139菌株仍然可以生长,表现出较强的耐胆汁酸能力;菌株间产丁酸盐能力差异显著,F31的丁酸盐产量最高,其次为F18、F20、F33和F139,且这4株菌株间产丁酸盐能力无显著差异;菌株F31使肠屏障功能受损,而其他菌株无明显影响。综合实验数据,筛选出F18和F139为优良菌株。本研究成功实现了普拉梭菌的分离鉴定及优良菌株筛选,为后续的体内实验研究提供了重要研究基础。     

人母乳中分离的葡萄球菌和链球菌菌株的抗氧化作用

代谢产生的自由基会对机体产生损害,因此寻找安全有效的天然抗氧化剂十分必要.本研究评价从人母乳中分离的6株葡萄球菌(Staphylococcus,S)和链球菌(Streptococcus,St)的抗氧化能力,这6株菌包括S.epidermidis R42、S.lugdunensis F270、S.lugdunensis B51、St.salivarius B39、St.salivarius F286和St.para-sanguinis F278.在体外,通过测试母乳中分离的葡萄球菌和链球菌的发酵上清液和热致死菌体清除DPPH·自由基、羟自由基和超氧自由基的能力及铁还原力,评价这6株菌的抗氧化能力.结果表明,S.epidermidisR42、St.parasanguinis F278和St.Salivarius F286的发酵上清液具有清除DPPH·自由基和羟自由基的能力;S.lugdunen-sis F270发酵上清液显示了清除DPPH·自由基的能力和铁还原的能力;St.salivarius F286、S.epidermidis R42和St.salivarius B39的菌体细胞具有清除羟基自由基的能力,St.salivarius F286的菌体细胞还显示了铁还原能力.因此,来源于母乳的S.epidermidisR42和St.salivarius F286的菌体细胞和发酵上清液、St.parasanguinis F278和S.lugdunensis F270的发酵上清液以及St.salivarius B39的菌体细胞,均具有抗氧化能力.本研究表明母乳中具有抗氧化能力的葡萄球菌和链球菌菌株可能对代谢活跃的哺乳期乳腺和新生儿肠道具有潜在的有益作用,值得进一步深入研究.     

小檗碱对大鼠肠道菌群结构的体外影响

目的研究小檗碱在体外对高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗大鼠(HFD)肠道菌群和正常饮食对照大鼠(NCD)肠道菌群结构的体外影响。方法采用体外厌氧培养、PCR-DGGE和454焦磷酸测序技术研究小檗碱对肠道菌群结构和多样性的影响。结果 DGGE指纹图谱和454焦磷酸测序结果都表明,小檗碱可以改变肠道菌群的结构,高剂量的小檗碱可以减少肠道微生物的多样性。应用偏最小二乘法判别模型分析(PLS-DA)挑选与小檗碱相关的细菌类群(OTU),在HFD组中挑选了55个关键OTUs,其中53个被明显抑制或消除,剩余2个分别属于Proteus和Escherichia/Shigella属的OTUs则被小檗碱富集。在NCD组中挑选的51个关键OTUs中,32个被小檗碱抑制,17个被小檗碱富集。被富集的除了属于Klebsielal属的OTU外,还包括可以产生短链脂肪酸的Lactobacillus、Blautia属的OTUs。结论小檗碱可以直接调节肠道菌群的结构,对不同结构的肠道菌群其作用也不相同,不同浓度的小檗碱对肠道菌群的影响有较大差异。高浓度的小檗碱可以抑制大部分细菌的生长(其中有很多为肠道条件致病菌),减少肠道微生物的多样性,富集Enterobacteriaceae科的细菌(Proteus、Escherichia/Shigella、Klebsielal)。相较于HFD组,小檗碱可以显著富集NCD组大鼠肠道菌群中的短链脂肪酸产生菌。     

造血干细胞移植术对肠道菌群结构的影响

目的监测造血干细胞移植术（Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT）前后肠道菌群结构的动态变化。方法收集3例造血干细胞移植患者手术前后8个时间点的粪便样品,提取样品总DNA进行16S rRNA基因的V3区的bar coded 454焦磷酸测序,并用MANOVA、聚类分析、Pearson相关等统计方法对菌群结构的变化进行动态分析。结果 HSCT移植前,经过放、化疗及预防性抗生素治疗,患者的肠道菌群结构和组成发生显著的改变,多样性明显减少;移植4周后,菌群多样性有恢复的趋势,但菌群结构和组成与治疗前仍有明显的差异。整个HSCT过程中,Escherichia/Shigella及Enterococcus属变成肠道中最优势的细菌类群。结论肠道菌群结构在HSCT术前已发生显著的改变,机会致病菌Escherichia/Shigella及Enterococcus属成为HSCT患者肠道中最优势的细菌类群。     

检测肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii的三对PCR引物的特异性比较

【目的】比较3对基于16S rRNA基因、用于检测人肠道中重要细菌Feacalibacterium prausnitzii的引物(FPR-1/FPR-2、FPR-2F/Fprau645R和Fprau223F/Fprau420R)的特异性。【方法】用Clustal X比对每个引物与F.prausnitzii和其他细菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project(RDP)数据库中使用Probe Match工具比较每个引物匹配的Faecalibacterium spp.序列数目。利用本课题组建立的中国人粪便菌群的16S rRNA基因全长文库的7255个克隆序列,用Simulated PCR(SPCR)预测每对引物检测到的F.prausnitzii和其他细菌的克隆数;用3对引物分别对代表克隆进行PCR扩增。用3对引物分别对14个健康人的粪便样品进行实时定量PCR。【结果】引物Fprau645R的3端最后一个碱基与非F.prausnitzii序列的错配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列数占其匹配的细菌序列数的百分比(97.6%)显著高于其他引物。SPCR预测,3对引物检测到的F.prausnitzii克隆数均为1171左右;在检测到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F/Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R还有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真实PCR与SPCR的结果吻合。实时定量PCR中,FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R检测到的细菌数量高于FPR-2F/Fprau645R。【结论】3对引物能检测到F.prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F/Fprau645R的特异性优于FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R。     

一种肠道硫酸盐还原菌的增菌培养基

目的针对已经分离、纯化的肠道硫酸盐还原菌,建立一种能快速、高效地培养菌体的培养基。方法比较营养丰富的GAM肉汤与常用于培养硫酸盐还原菌的选择性培养基Postgate的培养效果,摸索在GAM肉汤中添加不同浓度的硫酸盐对两种肠道硫酸盐还原菌-Desulfovibrio desulfuricans和Desulfovibrio intestina—zis的培养效果。确定效果最佳的改良GAM培养基配方,并测定在该培养基中D．desulful＇icans的生长曲线。结果与Postgate培养基相比,GAM肉汤能在2d内快速培养D．desulfugicans,但培养至6d时细菌数量大幅降低。在GAM肉汤中添加Na2SO4与FeSO4,在实验浓度范围内,均显著地促进硫酸盐还原菌的生长。在此基础上改良GAM肉汤培养基,培养得到的细菌数量较GAM肉汤显著提高。D．desulfuricans的生长曲线显示,2d时细菌生长达到最高峰,数量可达3．5×10^7 CFU／mL;培养6d,细菌数量为7．3×10^6 CFU／mL。结论基于GAM肉汤改良而得到的增菌培养基,能快速、高效地培养肠道硫酸盐还原菌,为后续进一步研究肠道硫酸盐还原菌的生理功能提供了支持。