猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxH基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化,它的突变apxⅡCA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxⅡCA基因发生同源交换,两步法筛选获得了apxⅡ基因突变株HBC^-／GFP^ ,PCR和Southern blot对突变株进行初步鉴定,进一步对突变株的一些生物学特性,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型RTX毒素I的N-端表达多肽具有良好的免疫原性

ApxI外毒素是猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)最重要的毒力因子,为了研究其N端多肽的免疫原性,分别将apxIA基因的全长编码区(apxIA,3146bp)及其5′端1140bp的片段(apxIA5)克隆到原核表达载体pET28a,经IPTG诱导后在大肠杆菌中实现了表达,表达产物ApxIA和ApxIAN均以包涵体的形式存在,Westernblot检测证实两种表达产物均具有免疫反应性。将纯化的重组蛋白(rApxIA和rApxIAN)和提取的天然毒素ApxI(nApxI)分别经腹腔免疫BALBc小鼠,于免疫前、免疫2周和4周后分别检测了ELISA抗体和毒素中和抗体水平,结果表明,rApxIAN免疫组的ELISA抗体显著低于rApxIA免疫组和nApxI免疫组,但rApxIAN免疫组血清中和试验中测定的溶血素单位与rApxIA及天然nApxI免疫组没有显著差异。第二次免疫2周后,用1个LD50的APP血清1型J101株和2型标准菌株攻击试验动物,rApxIAN免疫组对血清1型和2型菌株的保护率分别为80%和100%。     

表达ApxIA的血清7型胸膜肺炎放线杆菌弱毒菌株的构建及特性分析

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种高度接触传染疾病,严重阻碍着全球养猪业的发展,疫苗接种是控制该病的有效措施。为提高胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗的免疫效力,以及探索胸膜肺炎放线杆菌弱毒疫苗作为呼吸系统病原疫苗载体的可行性,通过穿梭质粒pJFF224-XN将完整的apxIA基因导入apxIIC基因缺失突变株HB04C-中,构建了含有apxIA和apxIIA基因的弱毒疫苗菌株HB04C2(apxIIC-/apxIIA+/apxIA+)。通过对HB04C2的生物学特性分析发现,穿梭质粒可稳定传代,并表达ApxIA,其生长特性未受穿梭质粒的影响。将HB04C2以气管接种方式免疫仔猪,可产生针对ApxIA和ApxIIA的抗体。二免后2周以高致病性的血清1型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,该弱毒疫苗可提供良好的免疫保护效果。     

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因无药物抗性标记突变株HBC-/GFP+的构建及其生物学特性研究

通过使用枯草芽胞杆菌一个蔗糖敏感sacB基因发展了一种依靠蔗糖的负向筛选系统 ,这种方法允许没有标记突变的基因进入胸膜肺炎放线杆菌染色体。首先 ,构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxII基因GFP插入失活型的重组质粒pOSAKCG ,其中一个表达盒含有氨苄青霉素基因和以外膜蛋白omlA作为启动子表达sacB基因。重组质粒pOSAKCG通过电穿孔转化 ,它的突变apxIICA基因与野生型亲本菌株胸膜肺炎放线杆菌HB03染色体上野生型apxIICA基因发生同源交换 ,两步法筛选获得了apxII基因突变株HBC^-GFP⁺,PCR和Southernblot对突变株进行初步鉴定 ,进一步对突变株的一些生物学特性 ,包括它的溶血活性、免疫原性、生长特性及其对小鼠的安全性进行了研究。结果表明 ,无药物抗性标记突变株的构建是成功的。该突变株的构建为进一步研究突变株作为载体和疫苗奠定了坚实的基础。     

血清7型胸膜肺炎放线杆菌apxⅡC-/apxⅠA+基因缺失重组菌株的构建与鉴定

通过接合转移和SacB负向筛选方法,成功构建了一株apxⅡC缺失的血清7型胸膜肺炎放线杆菌重组菌株。首先构建重组转移质粒pEHA1。将pEHA1转化供体菌大肠杆菌(E.coliβ2155),并将其与野生型APP血清7型亲本菌混合培养约5h,然后涂到含氯霉素抗性的培养基培养,挑取阳性克隆,接种到无抗性液体培养基,培养后涂于含有蔗糖的的固体培养基,培养一定时间后挑取蔗糖抗性的克隆,即可得到目的突变株。通过PCR、遗传稳定性、外毒素分泌、重组位点序列分析证明重组菌构建成功。通过对重组菌生物学特性进行初步研究,表明突变株生长能力未受影响,对小鼠毒力显著降低。该突变株构建体系的建立为猪传染性胸膜肺炎减毒活疫苗的开发及对胸膜肺炎放线杆菌新基因的功能研究奠定了良好基础。     

融合蛋白pIL6-IL2在E.coli中的表达及活性鉴定

白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL-2 )与白细胞介素 6(interleukin 6,IL-6)能分别刺激T淋巴细胞增殖与B淋巴细胞分泌免疫球蛋白 ,从而促进动物机体的细胞免疫与体液免疫 ;另外IL2与IL6在发挥生物学活性时还有相互协同作用。因此 ,将去除信号肽的猪白细胞介素 6(pIL-6)与猪白细胞介素 2 (pIL-2 )cDNAs序列通过一段Linker相连 ,克隆到E .coli表达载体pPET-2 8a中。该融合蛋白IL6-IL2在E .coli表达菌BL2 1 (DE3)中获得成功表达 ,SDS-PAGE分析分子量约为40kDa ,表达量达到总菌体的 66.26%。用IL6依赖的B9细胞与IL2依赖的CTLL细胞增殖试验进行融合蛋白IL6 IL2的生物活性检测 ,其活性可分别达到 0.8× 10³U /mg和 6.4× 10³ U/mg。