酵母亚细胞结构分离效率评估菌株的构建 *

背景: 真核细胞依赖其亚细胞结构高效地完成复杂的生化反应。尽管目前有一些亚细胞结构分离技术,但却缺乏评估这些分离技术的简单、有效方法。目的: 构建可以用来检测亚细胞结构分离效率的酿酒酵母菌株。方法: 通过传统的分子生物学与细胞生物学方法以酿酒酵母为背景构建了亚细胞结构分离效率评估菌株,并进行可行性检测。首先,将酵母各细胞器、自噬体及质膜的标记蛋白进行分组,用不同的蛋白标签分别标记每组蛋白。然后,以标记蛋白-GFP/RFP作为对照组通过免疫荧光法检测蛋白标签对标记蛋白的亚细胞定位是否有影响。最后,通过非连续性密度梯度离心验证该检测菌株能否用来检测亚细胞结构的分离效率。结果: 成功构建了酵母亚细胞结构分离效率评估菌株,该菌株标记了大多数酵母细胞亚细胞结构。挂标签的标记蛋白仍然定位在各自标记蛋白对应的亚细胞结构。非连续性密度梯度离心后,酵母各个亚细胞结构的标记蛋白均可以被检测到。结论: 该酵母亚细胞结构分离效率评估菌株是检测各亚细胞结构分离结果的方便工具,对今后酿酒酵母细胞生物学的研究有潜在的应用价值。     

酿酒酵母全基因组SNARE蛋白的亚细胞定位研究

在真核细胞中,内质网、高尔基体、质膜等膜结构间的蛋白质运输主要通过囊泡出芽和融合实现。SNARE蛋白家族在介导囊泡与目的膜结构融合过程中发挥关键作用。在模式生物酿酒酵母中,对全基因组SNARE蛋白的系统研究仍有不足。此研究构建了一套用于标记酿酒酵母基因组全部24种SNARE的工具质粒。该系列质粒既能呈现出良好的定位特征,又避免了过度表达造成的定位异常。通过与细胞器标记共定位验证了SNARE蛋白的亚细胞定位。结果发现3种SNARE的定位与之前报道不符:Bos1定位于早高尔基体,Snc1和Bet1定位于晚高尔基体/早内体。另外,Sec9定位于芽尖和芽颈,这是首次观察到Sec9在活酵母细胞中的定位。这项工作首次全面的检验了酵母SNARE家族蛋白的亚细胞定位,为后续SNARE蛋白功能研究提供了新线索,并为相关研究提供了一套工具质粒。     

人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。     

新型酵母蛋白表位标记和基因敲除质粒系统的构建及可行性验证

【目的】构建一套用于酿酒酵母基因功能研究的质粒。该套质粒结合pUG系列和pFA6a系列的优点,同时采用同尾酶实现蛋白表位标签的串联插入。【方法】利用PCR技术分别克隆pUG系列质粒的lox P位点、pFA6a质粒多酶切位点和ADH1终止子模块;通过重组连接各片段,构建pCLHN-TRP和pCLHN-URA质粒。在此基础上利用同尾酶实现多种蛋白表位标签的单个或串联重复插入,获得一系列蛋白表位标记质粒。最后,以ATG1、COX4和NHX1为例验证本质粒系列的性能。【结果】在本项工作中,我们共构建2种基因敲除用质粒和17种表位标记用质粒(涵盖1-8 FLAG、1-12 V5、3-9 HA、2-8MYC、GFP和m Cherry)。在几个靶基因上的应用证实了本套质粒的实用性。尤其值得指出的是,通过组合采用不同重复度的串联表位标签,在同一张膜上同时检测表达差异极大的不同蛋白而不使高表达蛋白信号饱和成为可能。【结论】本文所构建的pCLHN质粒系列是对现有酵母质粒工具的有益补充。     

新型小鼠跨区供血耳瓣模型的构建

目的：建立一个实时活体观察血管形态学变化小鼠跨区供血耳瓣模型。方法体重25～30 g清洁级ICR小鼠30只,双耳脱毛后,观察其血管分布情况。小鼠麻醉后,用眼科剪从尾侧向头侧剪断鼠耳基底部尾侧2/3,保留头侧1/3,形成耳前血管蒂跨三个血管体、二个choke区的耳瓣模型。将小鼠侧卧置于二维图像采集系统的动物承载台上,调节体视显微镜物镜并固定为25倍,设置步进参数,“弓”型路线渐次、局部采集造模后0,1,2,3,5,7,10,14,21,30 d的时间点图像,合成鼠耳全景图。重点观察皮瓣的坏死率、皮瓣内choke血管的形态学变化。结果 ICR小鼠耳有三个恒定的血管体来供养,从内到外依次为头侧血管体、中间血管体及尾侧血管体。术后5 d,耳瓣坏死面积趋于稳定,坏死率为（15±7）％。内侧血管体与中间血管体之间的choke动静脉的管径出现快速扩增,两者都在第10天左右达最大,choke静脉管径最高峰可达到原来的（3.9±0.5）倍,choke动脉管径最高峰可达到原来的（3.5±0.7）倍。10 d后,choke静脉管径开始减小,21 d后逐渐平稳,而choke动脉管径于术后10 d左右开始平稳,之后无明显减小。结论①跨区皮瓣切取后,静脉扩张是被动扩张,而动脉扩张是主动增值;②跨区皮瓣切取后血流动力学供区与潜力供区之间的choke区参与扩张的choke血管数量及扩张度均小于解剖供区与血流动力学供区之间的choke血管;③小鼠耳瓣模型为研究血管扩张机制及遴选促皮瓣存活药物的理想动物模型。     

酿酒酵母GPCR蛋白Ste2亚细胞定位信号探索

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族蛋白在细胞感受各种胞外信号过程中发挥重要作用。Ste2是酵母细胞中GPCR蛋白之一。大量文献报道了Ste2蛋白突变体对其功能和表达的影响,但关于Ste2亚细胞定位的研究相对较少。这项工作的目的在于确定Ste2亚细胞定位,探究Ste2不同跨膜域、胞内外环状结构域和N端、C端对其亚细胞定位的影响。构建了一系列结构域删除或替换突变体,通过荧光显微镜观察判断不同结构区域对Ste2亚细胞定位的影响,并通过与已知的细胞器标记蛋白共定位观察验证亚细胞定位判读结果。结果显示:野生型Ste2荧光信号出现在质膜和液泡内腔; C端缺失突变体荧光信号出现在质膜和内质网。在N端、C端、各环状结构域序列采用动物GPCR蛋白ORI7、OR17-40相应结构域替换的突变体中,C端替换导致液泡内腔信号消失,质膜信号强于野生型; N端和部分环状结构域替换不同程度减弱或消除了质膜定位,液泡腔内信号类似于野生型;部分突变体在胞内出现点状分布的荧光信号。由此推断:Ste2 N端,第一、第二胞外环状结构域和第三胞内环状结构域可能具有影响Ste2运输定位到质膜的功能;而C端则可能在Ste2离开细胞膜进入液泡的过程中发挥作用。初步确定了Ste2的不同结构区域对其定位的影响,为深入研究GPCR蛋白的亚细胞定位机制奠定基础。