蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的低底物浓度动力学

本文报道了对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的低底物浓度的动力学研究,采用酸碱指示剂方法能在0.25μmol/L的低底物浓度下对酶活力进行准确的测定。通过对动力学行为的分析,提出了蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的作用机制的模型,认为在低底物浓度和高底物浓度的情况下,酶催化水解果糖1,6-二磷酸的机制不同。推导得到了酶的初速度方程,用电子计算机拟合求得了七个表观动力学参数。统计检验表明,本文提出的机制能够较好地拟合实验结果。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的冷失活

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶在0℃左右很易失活。这是它不同于兔肌果糖1,6-二磷酸酯酶的一个特性。这种冷失活可被底物保护,提高溶液中酶蛋白的浓度可降低其失活程度。现有的结果表明,这一失活是不可逆的,且不伴随有亚基的解离或整个分子结构的松散;但用1-苯胺萘-8-磺酸作萤光探剂和用5,5'-二硫-二(2-硝基苯甲酸)与巯基反应可探测到酶分子在低温诱导下发生了比较小的构象变化。     

蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的研究——Ⅱ.蛇肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶和兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶稳定性的比较

本文比较了蛇肌GAPDH和兔肌GAPDH的稳定性。发现蛇肌Apo-GAPDH的热稳定性比兔肌Apo-GAPDH 和Holo-GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 的“熔点”为62.5℃。C,兔肌Apo-GAPDH 的“熔点”为52.5℃。55℃蛇肌Apo-GAPDH 的热失活速度比兔肌Apo-GAPDH 小得多,蛇肌Apo-GAPDH 活力损失一半的时间(t_(1/2)为1.2小时;兔肌Apo-GAPDH t_(1/2)为1.4分。Holo-GAPDH t_(1/2)为2.6分。热失活速度符合一级反应作图。底物存在热失活速度变小,NAD~ 对热失活的保护作用最大,当[NAD~ ]/[E]=240时,热失活速度蛇肌GAPDH 小32倍,兔肌GAPDH 小165倍,但蛇肌GAPDH 仍比兔肌GAPDH 稳定。蛇肌GAPDH 与兔肌GAPDH 的最适pH 相同,pH 稳定性蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 强。蛇肌Apo-GAPDH 在pH4.9～9.4稳定,兔肌Apo-GAPDH 的pH 稳定范围在pH6.1～8.1。ATP 在0℃也引起蛇肌GAPDH 失活,失活速度比兔肌GAPDH 小。结果表明蛇肌GAPDH 比兔肌GAPDH 稳定性强、结构紧密、亚基间结合力强。     

不同因素对人Ⅹ型磷脂酶A2 包涵体重折叠的影响

人 Ⅹ型磷脂酶 A2 在大肠杆菌中的表达产物完全以不溶的包涵体形式存在 . 用以前适用于人胰型 (IB 型 ) 磷脂酶 A2 的稀释重折叠方法,并不能使它有效重折叠 . 以初步纯化的包涵体为对象,发现溶液的温度、 pH 值和蛋白质浓度对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 体外重折叠有很大的影响 . 研究了一些小分子化合物对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 ,在高蛋白质浓度 (1 g/L) 下重折叠的影响,发现 1 mol/L 的 L- 精氨酸能提高其重折叠效率达 6 倍多 . L- 精氨酸的结构类似物 L- 瓜氨酸对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的重折叠有较弱的改善,而 L- 赖氨酸和 L- 精氨酸甲基酯则降低了 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的活性恢复 . 结果表明 , L- 精氨酸对蛋白质重折叠的帮助作用,可能是通过精氨酸与折叠中间物的结合产生的,精氨酸的胍基和羧基都是必需的,其侧链胍基以其特殊的带电方式阻遏了重折叠过程中的积聚和分子间二硫键形成的反应 .     

Single amino-acid substitution in the N-terminal arm altered the tetramer stability of rat muscle lactate dehydrogenase A

Lactate dehydrogenase A (LDHA) is a well-characterized tetrameric enzyme. Its N-terminal arm, comprised of an α-helix and a p-strand, was suggested to be essential for subunit interactions. To examine the critical amino acid residues in the N-terminus involved in the subunit association, two single-point mutants, Leu3Pro (L3P) and IIe8GIu (I8E), have been constructed. We compared the stability of WT-LDHA (WT) and its variants by unfolding experiments. For WT, a dimeric but inactive intermediate was observed by size-exclusion chromatography at 0.6-0.8 mol/L GdmCI. Leu3Pro exists in an active tetrameric structure in aqueous solution as WT does, but it dissociates into dimers under lower concentration of GdmCI (0.2 mol/L). In aqueous solution, the lle8GIu variant exists predominantly in the dimeric form with increased KM and decreased kcat as compared with those of WT and L3P. However, the activity of lle8GIu increases significantly in the presence of sodium sulfate. In conclusion, two mutants are less sta     

惟精惟一献身中华

王应睐先生已经离开了我们,离开了我们的研究所,远远地离去了。可是每当我走进生化大楼,我就听到他那稳重而又带着匆忙的脚步声,听到他那略带福建口音的呼唤声。     

通过自由能的差别划分蛋白质连续结构域

结构域是蛋白质三级结构下面的结构层次 ,大多数的蛋白质都可分为若干个结构域 ,结构域的不同组合使蛋白质具有不同的三级结构并具有不同的功能。蛋白质结构域的划分在理论与应用上都具有重要意义。但目前对结构域的划分还没有一个十分理想的方法。本文通过计算去折叠自由能来实现对蛋白质结构域的划分。用此方法对 5 0种不同蛋白质序列连续的双结构域进行了分析 ,大多数蛋白质的结构域划分结果与文献报道一致 ,另外一些虽然与文献报道结果不一致 ,但比文献报道的结果更合理     

猪肾果糖1,6-二磷酸酯酶N-端60肽的溶液构象

猪肾果糖1,6-二磷酸酯酶N-端60个氨基酸是结合AMP的别构部位的重要组成部分.这一段肽在天然酶中具有2段α-螺旋,不含β-折叠,螺旋含量占这段肽的60%左右.经枯草杆菌蛋白酶对果糖1,6-二磷酸酯酶限制性酶解可以专一地作用在这一位点.得到S-肽和S-蛋白,虽然S-肽与S-蛋白的肽键已经分开,但是它们依然缔合在酶的4个亚基之中.在9%的甲酸溶液中,用SephadexG-75柱(1.3×195cm)可以把S-肽与S-蛋白分开.除去甲酸后,用CD测定二级结构表明,S-肽有30%的α-螺旋和38.5%的转角或类似转角的二级结构,没有β-折叠.蛋白质的生物合成是从N-端开始向C-端延伸,新生肽在生物合成的过程中,它的构象由一级结构决定它自发形成某种结构的趋势,但是,其它部分的相互作用可以在较大程度上改变它的结构,使它最后形成天然状态的空间构象.用6mol/L盐酸胍破坏S-肽链的溶液构象,然后逐步透析去掉盐酸胍,重新测定CD的数值,所得结果与胍变性前的二级结构含量相同,用加入乙醇,环己烷,少量十二烷基磺酸钠等扰动方法都不能增加α-螺旋的含量.相反,随着加入量的增加,有序结构减少,说明当S-肽从酶上被分离下来后,在水溶液中只能形成其在该天然酶蛋白中的一半的螺旋,而另一半却变成转角或类似转角的有序结构的结果并不是由于分离过程产生的假象.     

胰岛素及其苄基衍生物在钠-氨系统中的还原及活力恢复

(1)应用三种不同的方法制得了胰岛素苄基衍生物。胰岛素如果用钠-氨还原再与氯化苄作用,可以得到不再有完整二硫键存在的充分苄基化的产物。(2)将胰岛素、S-磺酸型A及B链混合物或者胰岛素苄基衍生物,在钠-氨内还原,然后在稀碱溶液中重氧化,都可以使胰岛素活力再生。用胰岛素或S-B磺酸型A及B链混合物时,经过此处理则活力可以恢复5—10%。用胰岛素苄基衍生物时则一般活力恢复1—2%。(3)从充分苄基化了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实说明可以通过人工合成的A和B链最后合成胰岛素。(4)观察了A和B键混合物巯基氧化和活力再生的过程,并进行了讨论。     

蛋白质的结构转换

许多不相关的蛋白质含有相同的短肽序列却形成不同的空间构象. 结构转换广泛存在于蛋白质折叠和功能过程中, 具有重要的生物学意义. 综述了Serpin和EF-Tu的失活、血细胞凝集素的激活、蛋白酶成熟、亚基装配和蛋白质淀粉样化等过程中肽链同源肽段的结构转换模式, 并讨论了它在理解蛋白质折叠机理和“构象病”病因中的应用.