C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPAl中含有α毒素全基因。随后用NcoI／EcoRI酶切质粒pXCPAl,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXAl,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXAl)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16．28％。     

大肠杆菌肠毒素ST1、LTB基因融合及其免疫原性研究

目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。     

乳糖诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌茁β_2毒素基因表达影响

本研究对已构建的含茁2毒素基因重组质粒pE TXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测在不同培养条件下茁2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实pE TXB2重组质粒含有茁2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时,采用乳糖诱导剂通过改变培养基的pH值、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间四个方面对茁2毒素基因表达进行调控,从而为茁2毒素基因工程菌的工业化生产提供了可靠的试验数据。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

C型产气荚膜梭菌β1毒素基因表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出β1毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对其进行双酶切处理,回收0．95kb的β1毒素基因片段,最后将其定向克隆在事先经同样内切酶处理的载体pET-28c中相应位点上,转化至受体菌B121(DE3)qh。经BamHI和Eco RI双酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXBl含有B毒素基因,并且具有正确的基因序列和阅读框架。重组菌株BI21(DE3)(pETXB1)经IPIG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达β1毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的12．24％。     

C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达*

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1.2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPA1中含有α毒素全基因。随后用NcoI/EcoRI酶切质粒pXCPA1,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXA1,经NcoI/EcoRI和BamHI/E     

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1融合基因表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1)。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1融合蛋白能够被α、β1毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5944毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。     

C型产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了0．72kb的β2毒素基因,将纯化的PER产物与载体pGEM—T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／Bam HI和Bam HI／Eco RI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPB2中含有陡毒素基因。随后用Nco I／Bam HI酶切质粒pXCPB2,回收β2毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXB2,经Nco I／Bam HI和Nco I／Hind Ⅲ／Bam HI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有陡毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21（DE3）（pETXB2）表达产物经ELISA检测和SDS—PAGE分析,重组菌株表达的β2毒素蛋白能够被如毒素抗体识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的13．26％。